[发明专利]一种绒山羊的DCN基因过表达载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种绒山羊的DCN基因过表达载体的构建方法。

背景技术

饰胶原蛋白(decorin，DCN)为一种蛋白聚糖(proteoglycan，PG)，是一种多效性分子，因最初发现其结合“修饰”胶原而得名。在调节细胞粘附、迁徙、增殖、胶原纤维形成及调节TGF-β活性中起重要作用。目前，还没有一种绒山羊的DCN基因过表达载体的构建方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的存在的缺陷，提供一种绒山羊的DCN基因过表达载体的构建方法。该方法在克隆绒山羊DCN基因cDNA序列的基础上，构建过表达载体pEGFP-CI/DCN，为后续研究绒山羊DCN基因功能奠定基础。

其具体技术方案为：

一种绒山羊的DCN基因过表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)DCN基因克隆

绒山羊皮肤总RNA提取，cDNA第一条链的合成，设计引物DCN-F、DCN-R，以cDNA为模板，使用引物DCN-F、DCN-R和Phusion高保真DNA聚合酶，按常规方法进行PCR扩增；反应条件为：98℃5min；98℃30s、59℃2min、72℃2min，30个循环；72℃10min；PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定；

(2)过表达载体pEGFP-CI/DCN的构建

利用限制性内切酶BamHI和EcoRI对纯化后的目的基因与真核表达载体pEGFP-CI同时进行双酶切，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；回收后的目的基因片段和经同样双酶切的表达载体pEGFP-CI进行连接；反应体系为：T4DNA连接酶1μL、pEGFP-CI纯化产物1μL、PCR产物3μL、dH2O3μL、10×buffer1μL，16℃过夜连接；将连接产物加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，立即移入冰中静置5min，之后加入500μL37℃预温的无抗性LB培养基，37℃摇床培养1h，最后将菌液均匀涂布含有Kanamycin的LB固体培养基上，放入37℃生化培养箱内过夜培养，筛选阳性菌落；随机挑取15株单克隆菌落，用PCR法鉴定阳性克隆菌落；按照天根公司的质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒；用PCR法、单双酶切鉴定连接后将菌液送到Invitrogen公司测序；所得到的重组真核表达质粒命名为pEGFP-CI/DCN。

本发明的有益效果是：

本发明通过构建DCN基因的过表达载体pEGFP-CI/DCN。后续开展过表达DCN基因对成纤维细胞、角质化细胞生长发育影响的研究，进而探索该基因在毛囊生长发育中的作用机制。

附图说明

图1为DCN基因的扩增；1.DNAMarker(DL5000)；2.PCR产物；

图2为重组质粒单双酶切鉴定，1.DNAMarker(DL5000)；2.PCR产物t；3.BamHI酶切pEGFP-CI/DCN产物；4.BamHI和EcoRI双酶切pEGFP-CI/DCN产物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1材料与方法

1.1材料：绒山羊皮肤样品采自内蒙古白绒山羊种羊场成年母羊群体。

1.2方法

1.2.1DCN基因克隆

绒山羊皮肤总RNA提取，cDNA第一条链的合成，设计引物(DCN-F、DCN-R)，以cDNA为模板，使用引物DCN-F、DCN-R和Phusion高保真DNA聚合酶，按常规方法进行PCR扩增。反应条件为：98℃5min；98℃30s、59℃2min、72℃2min，30个循环；72℃10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。DCN-F的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，DCN-R的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示.

1.2.2过表达载体pEGFP-CI/DCN的构建