[发明专利]酶促cGAMP生成量检测所用RNA适配体及检测方法

权利要求书

1.一种体外酶促反应cGAMP生成量检测所用RNA适配体，其特征在于，该RNA适配体包括spinach2，VC2/g20a和tRNA三部分，碱基序列如SEQ ID NO.1 所示，即：

GCCCGGAUAGCUCAGUCGGUAGAGCAGCGGCCGGAUGUAACUGAAUGAAAUGGUGAAGGACGGGUCCACACGCACAGAGCAAACCAUUCGAAAGAGUGGGACGCAAAGCCUCCGGCCUAAACCAGAAGACAUGGUAGGUAGCGGGGUUACCGAUGUUGUUGAGUAGAGUGUGAGCUCCGUAACUAGUUACAUCCGGCCGCGGGUCCAGGGUUCAAGUCCCUGUUCGGGCGCCA。

2.权利要求1所述RNA适配体的制备方法，其特征在于，该RNA适配体利用T7 RNA聚合酶体外转录体系转录生成，具体包括以下步骤：

（1）人工合成制备转录用双链DNA模板，首先人工合成单链DNA模板，然后以人工合成单链DNA序列为模板，PCR扩增得到双链DNA片段后即可作为后续体外转录反应所需模板；

所述单链DNA序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

5’-CGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAGCGGCCGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCACACGCACAGAGCAAACCATTCGAAAGAGTGGGACGCAAAGCCTCCGGCCTAAACCAGAAGACATGGTAGGTAGCGGGGTTACCGATGTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCCGTAACTAGTTACATCCGGCCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCA；

（2）体外转录RNA适配体，利用T7 RNA聚合酶构建体外转录体系，转录RNA适配体。

3.如权利要求2所述RNA适配体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中体外转录体系设置如下：

5×转录缓冲液，20 μL；

ATP，100 mM、2 μL；

GTP，100 mM、2 μL；

CTP，100 mM、2 μL；

UTP，100 mM、2 μL；

步骤（1）所制备DNA模板，0.1 μg/μL、10 μL；

RNA酶抑制剂，40 U/μL、4 μL；

T7 RNA聚合酶，10 U/μL、4μL；

焦磷酸酶，0.1 U/μL、4 μL；

MgCl₂ ，100 mM、2 μL；

V/V 0.1%的DEPC水，48 μL；

37℃下反应2 h后加入DNaseI 2μL，继续在37℃下反应30 min，然后加入2 μL EDTA溶液终止反应；

将终止后反应液在70℃条件下加热5 min，然后退火至室温，冰上放置备用。

4.权利要求1所述RNA适配体在体外酶促反应cGAMP生成量检测中的应用，其特征在于，检测体系设置如下：

酶促反应产物，80 μL；

RNA适配体，10 μL；

KCl，1.5 M、8 μL；

MgCl₂，100 mM、5 μL；

DFHBI，1 mM、1 μL；

检测体系在冰上配制，各组分混合均匀后，放入恒温孵育器中，25℃下结合30 min，然后加入到96孔微孔板中，利用荧光微孔板读数仪检测荧光信号，从而确定cGAMP生成量。

5.如权利要求4所述RNA适配体在体外酶促反应cGAMP生成量检测中的应用，其特征在于，所述酶促反应产物，为利用原核表达系统表达纯化VC0179酶蛋白所进行的cGAMP酶促生成反应产物，VC0179酶蛋白基因编号为GeneBank：NC_002505.1。