[发明专利]牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法

说明书

本发明提供牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，本发明涉及口腔医学领域。所述方法包括如下步骤：扩增牙龈卟啉单胞菌RgpA基因的上、下游同源臂；扩增红霉素抗性基因片段；构建两端为所述RgpA基因的上、下游同源臂，中间为红霉素抗性基因片段的同源重组片段；将同源重组片段转化入牙龈卟啉单胞菌内，进行同源重组，采用红霉素抗性平板筛选，获得牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株。本发明牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，操作简便灵活，无需繁琐的酶切连接和筛选，对突变位点的选择无特异性要求，重组效率高。

技术领域

本发明涉及口腔医学领域，具体涉及牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法。

背景技术

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，缩写为P.g)是一种非酵解糖的革兰氏阴性厌氧球杆菌，是研究广泛且证据充足的重要牙周致病菌之一。国外有学者研究发现37％的0～18岁个体中均可检测到P.g。牙龈素(Gingipains)是P.g在细胞内合成并分泌到细胞外的一种胰蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶,在其致病性中起着重要作用。它包括具有与赖氨酸残基特异结合活性的牙龈素蛋白酶K(gingipainK,Kgp)和与精氨酸残基特异结合活性的牙龈素蛋白酶R(gingipainR,Rgp)。其中,Rgp包括RgpA和RgpB两种存在形式。为了研究牙龈卟啉单胞菌的致病机制、寻找治疗方法，需要研究上述蛋白酶的相关功能。通常采用敲除目的基因的方法，来研究牙龈蛋白酶的功能。但是，采用常规方法敲除牙龈蛋白酶，需要进行大量的筛选工作，工作效率较低。

发明内容

本发明的目的是提供牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，该方法简单高效。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，包括如下步骤：

(1)扩增牙龈卟啉单胞菌RgpA基因的上、下游同源臂；

(2)扩增红霉素抗性基因片段；

(3)构建两端为所述RgpA基因的上、下游同源臂，中间为红霉素抗性基因片段的同源重组片段；

(4)将同源重组片段转化入牙龈卟啉单胞菌内，进行同源重组，采用红霉素抗性平板筛选，获得牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株。

在本发明中，所述上游同源臂的序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游同源臂的序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明中，步骤(4)中采用电转化方法将同源重组片段转化入牙龈卟啉单胞菌内，电击条件为：电压为2.5kV、电击时间为5ms。

在本发明中，以牙龈卟啉单胞菌的基因组DNA为模板，以upF和upR为引物，扩增RgpA基因的上游同源臂；以牙龈卟啉单胞菌的基因组DNA为模板，以downF和downR为引物，扩增RgpA基因的下游同源臂；所述upF的序列为：ccgaattcGGATACGGGTTCGTCTATGTAGCGGCGGAAAAATGC：所述upR的序列为：CGGAAGCTATCGGGGGTACCGTTTTTCATTTTGATG所述downF的序列为：CTAGAGTCGACCTGCAGTTCTGTCTTGGACTCGGAG所述downR的序列为：aaggatccTATCTATCTCATGCCGGAGGCGGAAGGTGGTAACTC。

有益效果：本发明牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，操作简便灵活，无需繁琐的酶切连接和筛选，对突变位点的选择无特异性要求，重组效率高。

附图说明