[发明专利]一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法

说明书

本发明公开了一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，其包括在液体培养基中发酵培养产巴卡廷III的红豆杉内生菌Diaporthe phaseolorum的菌株no.79，当真菌在培养基中培养2天(48小时)后，第一次加入30ml的双氧水，然后每隔3天分别加入60ml的双氧水，直至第21天发酵结束，通过该氧化培养环境，以使在所述菌株处于氧化胁迫环境中，同时为真菌生长提供叫足够的氧气，最终提高所培养内生真菌的巴卡廷III产生量。本发明相比较传统发酵培养方法，显著的提高了菌株no.79的产率，方法简单且经济，适宜于工业化生产，巴卡廷III产率可提高1.8倍。

技术领域

本发明属于真菌培育技术领域，具体涉及一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法。

背景技术

紫杉醇被广泛用于癌症的化疗，尤其是对乳腺癌、子宫癌和卵巢癌等女性高发癌症具有良好的效果，但是其人工合成工艺复杂，所以依然不能依靠人工合成生产。目前，医用紫杉醇提取自红豆杉，然而紫杉醇在红豆杉中含量极低，同时红豆杉生长极其缓慢，但紫杉醇前体物巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III含量较高，因此，通过巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III人工半合成获得紫杉醇是当今该药的主要途径。尽管红豆杉中巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III含量较之紫杉醇高，但依然不能满足市场需求，导致紫杉醇价格依然昂贵，不能充分满足市场需求。因此，如何快速生产巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III成为影响紫杉醇市场价格的主要因素。

近年来，分离自红豆杉的一些内生菌被发现能够产生巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III，这为通过发酵手段生产紫杉醇前提物提供了现实基础，但是，相比较红豆杉中巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III的含量，内生菌发酵的产生较低，因此，如何通过适当的手段来提高其发酵产量成为这些内生菌能否应用到生产的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，解决了现有技术中存在的发酵法产巴卡廷III产率较低的问题。

本发明所采用的技术方案是，一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，包括以下步骤：在液体培养基中培养产巴卡廷III的红豆杉内生菌，Diaporthephaseolorum的菌株no.79，当真菌在培养基中培养一段时间后，第一次加入双氧水，然后每隔3天添加一次双氧水，直至发酵结束，得到真菌培养液，并对真菌培养液进行回收和提纯。

本发明的特点还在于，

培养基为PDB培养基，其组成为:水1000ml、马铃薯600g、蔗糖280g、pH 6.5-7.0。

培养一段时间的具体时间长度是2天。

第一次加入双氧水的量为每1000ml培养基中加入30ml双氧水。

每隔三天加入双氧水的量为每1000ml培养基中加入60ml双氧水。

回收并提纯巴卡廷III的步骤包括：

1)真菌培养液用滤纸过滤备用，菌丝体残渣加入石英砂被充分研磨，研磨的后的残渣在45℃条件下被充分干燥，然后称重备用；

2)将干燥称重后的菌丝体粉末放入30ml体积比为1:1的氯仿/甲醇混合液，充分混匀为悬浊液，然后在超声波震荡30分钟，过滤，将滤渣采用上述方法提取；

3)合并两次所得滤液并在40℃条件下低压旋转蒸发，然后将所的到的膏状蒸发残留物溶解在30ml氯仿中，然后用30ml的水再次抽提；

4)收集有机相，并在旋转蒸发器中40℃旋转蒸发，所得干燥残留物被溶解在5ml的甲醇中，并用0.45lm孔过滤器过滤备用；

5)过滤后的真菌培养液在70℃条件下低真空旋转蒸发；