[发明专利]双重定量真菌毒素量子点荧光免疫层析试纸条及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫层析技术，具体地说，是涉及同时对食品中两种真菌毒素同时进行检测的以量子点标记真菌毒素特异性单克隆抗体和荧光显色为基础的免疫层析试纸条的制备方法。

背景技术

现阶段常发的各类中毒事件，除了某些由无机化合物如氰化钾、砒霜引起外，绝大部分都是来自生物毒素，而微生物毒素是最常见的，食物中毒绝大部分是细菌毒素或真菌毒素引起的，真菌毒素由于污染范围广、毒性强等特点日益受到食品安全监测领域的高度重视。

真菌毒素是真菌产生的小分子次级代谢产物，是粮食和饲料中的重要污染物。真菌毒素的检测常见的方法是酶联免疫法(ELISA)，虽然酶联免疫法操作简单，结果易获取，但需要配套的设备，如恒温培养箱、酶标仪等等，且往往耗时较长，不能用于临床或现场的快速诊断。相比ELISA，免疫层析试纸条可用于现场的快速检测，并且不需要其他辅助仪器，可弥补其他检测方法复杂而耗时的缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中酶标免疫技术耗时长和常规胶体金免疫层析试纸条灵敏度不高以及单通道等缺点，提供了一种检测真菌毒素的量子点荧光免疫层析试纸条及制备方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种同时检测两种真菌毒素的量子点荧光免疫层析试纸条，包括作为基材的黑色长条状聚氯乙烯背板，在沿背板长度方向在其表面依次布置样品垫、量子点抗体标记物固定垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，相邻垫或膜间彼此搭接；在硝酸纤维素膜上，设有与背板同宽的彼此间隔的两条检测线和一条质控线，其中质控线位于吸水垫一侧；

在量子点抗体标记物固定垫上，以喷涂、敷涂或浸泡的方式固定有真菌毒素单克隆抗体与羧基水溶性量子点的标记复合物；所述质控线是将山羊抗鼠多克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成，所述检测线是将待检真菌毒素偶联抗原喷涂于硝酸纤维素膜上形成，两条检测线所含真菌毒素偶联抗原是不同的。

本发明中，所述量子点抗体标记物固定垫上的真菌毒素单克隆抗体与羧基水溶性量子点的标记复合物，其制备方法是：

以浓度为0.01M、pH＝7.4的硼酸盐缓冲液分别配置偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，浓度均为10mg/ml；取50μl羧基修饰的水溶性量子点至2mlEP管，加200μl浓度为0.05M、pH＝6的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液，并根据水溶性量子点上的羧基数目加入EDC和NHS溶液；室温摇床活化30min后15000rpm离心30min弃上清后加入1ml含5μg特异性真菌毒素单克隆抗体的pH＝6、0.05M的MES缓冲液；室温摇床反应2h后15000rpm离心30min弃上清，并用1ml0.01M、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，离心，洗去未反应的抗体；重复上述的重悬、离心操作三次；最终加100μl的0.05M、pH＝8.0的硼酸盐缓冲液作为保存液，得到真菌毒素单克隆抗体与羧基水溶性量子点的标记复合物，在4℃放置，备用。

本发明中，所述真菌毒素单克隆抗体所对应的真菌毒素，是赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素等中的任意一种。

本发明中，该试纸条的宽度为0.4cm，样品垫、量子点抗体标记物固定垫、硝酸纤维素膜和吸收垫的长度分别为1.7cm、0.8cm、2.5cm、1.7cm；其中，样品垫与量子点抗体标记物固定垫的搭接重合长度为0.2cm，量子点抗体标记物固定垫与硝酸纤维素膜的搭接重合长度为0.2cm，硝酸纤维素膜与吸收垫的搭接重合长度为0.3cm；在硝酸纤维素膜上，两条检测线及检测线-2与质控线之间的间距分别为0.4cm、0.4cm。

本发明进一步提供了制备前所述量子点荧光免疫层析试纸条的方法，包括下述步骤：

(1)制备量子点抗体标记物固定垫