[发明专利]一种枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的定向固定化方法

权利要求书

1.一种基于虚拟筛选技术的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的定向固定化方法，其特征在于具体包括如下步骤：

（1）、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶活性位点及结合位点的确定

①、从SWISS-PROT数据库中获取ID为C1KF31的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的三维结构，通过数据库给出的数据确定His-364、Glu-365、His-368、Tyr-379、Glu-388、Arg-417、Tyr-445和His-449和His-449组成的催化椭圆区作为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点；

②、将枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的三维结构上传至蛋白表面三维结构计算平台，选择远离活性区域，且与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点的氨基酸的带电性质、疏水性有明显区别的SER-358，LEU-359，ASP-360，ASP-399，GLU-401，GLU-407，ASP-408 7个氨基酸残基组成的区域作为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点；

（2）、亲和配基葡萄糖酸洗必泰在载体弱酸性阳离子交换树脂表面上的固定

①、载体弱酸性阳离子交换树脂的预处理

将弱酸性阳离子交换树脂置于酶反应器内，按照弱酸性阳离子交换树脂重量：自来水重量=1：1.5的比例，将弱酸性阳离子交换树脂加入到自来水中搅拌清洗2遍，去除自来水；

然后，按照弱酸性阳离子交换树脂重量：双蒸水重量=1：1.5的比例，将弱酸性阳离子交换树脂加入到双蒸水中搅拌清洗3遍，然后去除双蒸水；

然后再按照酸-碱-酸的顺序，依次分别将弱酸性阳离子交换树脂加入到0.55mol/L HCl、0.55mol/L NaOH和0.55mol/L HCl中对弱酸性阳离子交换树脂进行洗涤，每次洗涤完毕后用双蒸水清洗弱酸性阳离子交换树脂，直至流出液中pH至7为止，即得经预处理过的弱酸性阳离子交换树脂；

所述的弱酸性阳离子交换树脂为丙烯酸型DIAION WK40树脂；

②、载体弱酸性阳离子交换树脂的活化

称取6g步骤①所得的经预处理过的弱酸性阳离子交换树脂，加入到含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，在25℃恒温条件下搅拌活化1h，倒去含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，然后用双蒸水对弱酸性阳离子交换树脂进行洗涤，直至流出液在紫外区无吸收，即得活化后的弱酸性阳离子交换树脂；

上述的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，即将10.0068 g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 4.002 gN-羟基琥珀酰亚胺溶解于30mL，pH6.0，浓度为0.1mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸的水溶液中；

③、亲和配基葡萄糖酸洗必泰在弱酸性阳离子交换树脂表面的固定

取6g步骤②所得的活化后的弱酸性阳离子交换树脂，加入39mL浓度为200mg/mL葡萄糖酸洗必泰水溶液，室温下搅拌反应12h，反应完毕后，用双蒸水洗去未固定的葡萄糖酸洗必泰，即得固定有葡萄糖酸洗必泰的弱酸性阳离子交换树脂；

（3）、定向固定化枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的制备

①、亲和配基葡萄糖酸洗必泰与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点的对接

将6g步骤（2）中的③所得的固定有葡萄糖酸洗必泰的弱酸性阳离子交换树脂置于30mL浓度为1mg/mL的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲溶液中，于25℃下反应2h，反应完成后倒掉上清液，即得对接有中性蛋白酶的固定有葡萄糖酸洗必泰的弱酸性阳离子交换树脂；

上述的浓度为1mg/mL的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲溶液，配制所需的溶剂为pH7.5、浓度为0.02mol/L 的磷酸氢二钠水溶液或pH7.5、浓度为0.02mol/L 的磷酸二氢钠水溶液；

②、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶在载体弱酸性阳离子交换树脂上的固定

称取6g①中所得的对接有中性蛋白酶的固定有葡萄糖酸洗必泰的弱酸性阳离子交换树脂，加入到30ml含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，室温下搅拌反应12h，反应完毕后，用双蒸水洗去未固定的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，即得定向固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶；

上述的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，即将10.0068 g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 4.002 gN-羟基琥珀酰亚胺溶解于30mL，pH6.0，浓度为0.1mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸的水溶液中所得。