[发明专利]一种检测哈氏弧菌的LAMP引物组及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，更具体地，涉及一种检测哈氏弧菌的LAMP引物组及其试剂盒。

背景技术

我国的水产养殖业发展迅速，水产养殖种类多样，是世界上唯一的养殖量大于捕捞量的国家，但我国几乎所有的养殖品种都会受到疾病的威胁，我国的水产养殖业每年会因病害损失百亿元之巨。造成这种巨大损失的重要原因之一就是缺乏病害快速检测能力。由于我国的水产病害快速检测技术还不成熟，所以基层工作者对病害的检测往往依赖于肉眼的观察以及经验的判断，误判误诊现象普遍，缺乏快速有效的检测手段。

    海马是一种经济价值较高的名贵中药，具有强身健体、补肾壮阳、舒筋活络、消炎止痛、镇静安神、止咳平喘等药用功能，同时海马还具有很好的观赏价值。目前海马资源紧缺，价格昂贵，市场需求量在不断增加。然而海马的人工养殖却是一个世界性难题，巨大的市场空缺主要通过进口来填补。中科院南海所2009年首次引进美国线纹海马，通过几年的室内小试、室外中试以及规模化生产，已取得成功。目前海马的生物学研究尚不够系统，养殖技术还不成熟，海马养殖产业仍处于起步阶段。病害问题是目前海马养殖产业所面临的“瓶颈”之一。而海马的病害如气泡病、烂肤病、肠炎病、烂尾病等的致病机理还未知。其中，烂尾病和肠炎病是海马养殖中很常见的病害，具有发病广和危害重的特点，一旦发病，海马的死亡率极高。目前已经有报道哈氏弧菌是造成海马病害的一种致病菌，而我们从海马的病灶组织的病菌分离鉴定中也发现，哈氏弧菌在肠炎病和烂尾病的发生过程中起着重要的致病作用。哈氏弧菌是海水中常见的一种致病菌，对鱼、虾、贝类等海水养殖动物均有致病性。因此，在海马养殖病害检测中建立哈氏弧菌的快速检测方法是非常紧迫而必要的。

    目前检测致病微生物的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定方法，该方法所需时间长，一般情况下需要5～7 d，有时达到10～15 d，很难满足快速检测的要求；近些年发展起来的PCR技术是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，并且该方法需要较为昂贵的仪器设备和专业的实验技术，在大规模的养殖环境中很难满足实际操作的需要。ELISA 方法具有快速、灵敏的特点，是比较受欢迎的一种鉴定方法，但是所使用的试剂盒均来自国外，价格昂贵，并且需要配备专门的仪器。环介导等温扩增技术（LAMP）是继 PCR 技术之后发展起来的基于检测病菌遗传物质（DNA）的一种新的扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列，该技术的特点是无需特殊昂贵的检测仪器，操作简单，只需简单的恒温设备即可完成PCR扩增，可以满足现场检测的需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有哈氏弧菌检测所存在的上述问题，提供一种特异性检测哈氏弧菌的特异性引物。

本发明的第二个目的是提供含有上述引物的试剂盒。

本发明的第三个目的是提供上述试剂盒在检测哈氏弧菌中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种检测哈氏弧菌的特异性引物组，所述特异性引物组包含一对外侧引物F3/B3和一对内侧引物FIP/BIP，引物序列如SEQ ID NO：1～4所示。

申请人从GeneBank数据库中查找哈氏弧菌vhh基因的序列（登录号为：FJ025787），通过将此序列与其他弧菌的相关基因进行比对以确保其扩增的特异性，用Primer Premier 5.0引物设计软件来设计引物，得到如SEQ ID NO：1～4所示的引物序列。

本发明还提供含有上述特异性引物组的、用于检测哈氏弧菌的LAMP试剂盒。

优选地，所述LAMP试剂盒中外侧引物的浓度为10mM，内侧引物的浓度为20mM。

更优选地，所述LAMP试剂盒还包括反应缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs。

优选地，所述LAMP试剂盒的LAMP反应体系为：反应缓冲液2.5 μL、dNTPs 3 μL、甜菜碱2 μL、MgSO₄ 2 μL、外侧引物各0.5 μL、内侧引物各2 μL，DNA聚合酶1 μL，模板DNA 2 μL，余量用超纯水补齐至25 μL。

其中，dNTPs的浓度为10mM，甜菜碱的浓度为7.5～10M，外侧引物的浓度为10mM。内侧引物的浓度为20mM，DNA聚合酶的浓度为8000U/mL。

其中，所述反应缓冲液可以选择10× ThermoPol反应缓冲液（购自New England Biolabs公司）。