[发明专利]烟草花叶病毒LAMP检测用的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种烟草花叶病毒LAMP检测用的试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

烟草花叶病毒tobaccomosaicvirus缩写TMV，为RNA病毒，专门感染植物，尤其是烟草及其他茄科植物，系Tobamovirus属的代表种。该病毒是伊凡诺夫斯基D.I.Iwanowski于1892年首次证明了这个TMV的存在。斯坦利W.M.Stanley于1935年首先从烟草病叶榨汁中分离到TMV病毒状结晶，其以了解到这个蛋白质还含有核酸，并肯定病原就是这个病毒。该病毒极其稳定，因在病叶内能大量地增殖，所以从1升病叶榨汁中可提纯2克结晶。TMV粒子长300纳米、直径18纳米，有一条分子量为2×10⁶道尔顿的单链RNA。核酸被2130个分子量为17530道尔顿的蛋白质亚基所包裹。TMV的寄主范围是十分广泛，现已知对22科植物中的198种植物都具有侵染性，如烟草及各种蔬菜等，是目前植物病毒中寄生范围最为广泛的病毒之一。

该病毒的致死温度是90-93℃经10分钟，稀释限点10⁶倍，体外保毒期72-96小时。在无菌条件下致病力达数年，在干燥病组织内存活30年以上。而且该病毒有不同株系，我国主要有普通株系、番茄株系、黄斑株系和珠斑等4个株系，因致病力差异及与其他病毒的复合侵染而造成症状的多样性。

TMV能在多种植物上越冬，初侵染源为带病残体和其它寄主植物，另外未充分腐熟的，带毒肥料也可引致初侵染。它主要通过汁液传播，病健叶轻微摩擦造成微伤口，病毒即可侵入，不从大伤口和自然孔口侵入，侵入后在薄壁细胞内繁殖，后进入维管束组织传染整株。在22—28℃条件下，染病植株7—14天后开始显症，田间通过病苗与健苗摩擦或农事操作进行再侵染。另外烟田中的蝗虫、烟青虫等咀嚼式口器的昆虫也可传播。

由于该病毒寄生范围广，可以侵染多种农作物、而且极易传播、带病毒残体潜伏侵染时间又非常长，给防治该病毒带来了极大的困难，每年都会给农作物造成无法估量的损失，因此最经济有效的控制策略是对种苗就进行检测，发现TMV病毒的及时淘汰，在源头上把好防治病毒关。

目前植物病毒的检测方法主要有生物学、血清学和分子生物学三种，生物学方法就是用病毒指示植物来检测病毒的存在与否，一般需要7-10天；血清学方法是根据抗原抗体的特异性结合来检测病毒，一般只需要4-6小时左右，但是它需要特异性的抗血清，而且检测灵敏度不高，还存在有非特异性问题；分子生物学方法主要是指PCR方法，该方法快且准确性也比较高，但是需要昂贵的检测仪器和相关设备，而且对于像TMV这个病毒，由于其稀释限点是10⁶倍，即将病汁液稀释到10⁶倍才失去侵染力，故需要灵敏度非常高的检测方法才能将潜在的TMV检测出来，以上三种方法灵敏度都难以达到，这样必将存在漏检的可能，所以急需研究新的检测方法。

目前已有的检测方法，其检测步骤繁琐，采用仪器昂贵，不能快速、方便的实现鉴别鱼翅真伪。故此，现有鉴别鱼翅真伪的检测方法有待进一步完善。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种烟草花叶病毒LAMP检测用的试剂盒；采用本发明试剂盒检测烟草花叶病毒的方法具有快速、检测灵敏度高、操作简单、结果直接可以判读等特点。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种烟草花叶病毒LAMP检测用的试剂盒，其特征在于包括：

其中所述引物包括：

正向外引物F3：5'-TTACGGAATTACTACTCCATCT-3’；

反向外引物B3：5'-GGTCTAATACTGCGTTGTACC-3’；

正向内引物FIP：

5'-TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA-GTGTTCTTGTCATCAGCGT-3’；

其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：

F1c：TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA；

F2：GTGTTCTTGTCATCAGCGT；

反向内引物BIP：

5'-CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC-ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA-3’

所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：

B1c：ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA；

B2：CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC。