[发明专利]小花矮牵牛原生质体的制备方法

说明书

本发明公开了一种小花矮牵牛原生质体的制备方法；该方法包括以下步骤：在黑暗条件下，将幼嫩叶片置于3～5℃清水中预处理20～25h；用酶解液酶解预处理后的叶片；加入和酶解液等体积的CPW洗液，摇匀，300目细胞筛过滤，转速1100r/min离心2min，吸去上清液；向沉淀中加入CPW洗液洗涤原生质体，转速1100r/min离心2min，收集沉淀加入悬浮液悬浮，即得到产量为(5.0±0.3)×10⁶个/g，活性达到85％的原生质体，9h后80％的原生质体可维持活性。用本发明的分离方法获得了高活性、高产量及状态良好的原生质体，可满足原生质体的培养及植株再生的条件，为植物原生质体融合培育新品种提供实验材料。

技术领域

本发明涉及一种小花矮牵牛原生质体的制备方法。

背景技术

小花矮牵牛(Calibrachoa hybrid)又名舞春花，是茄科Calibrachoa属草本花卉，因花色丰富、花型优美，花期长及花量大，株型丛状紧凑，对介质中高PH值有很好的耐性等特点被广泛应用于城市园林绿化，商业发展潜力巨大。同时还可作为育种资源，与其它植物进行原生质体融合培育新品种，特别是可为黄色矮牵牛的培育开辟一条新的途径。

酶液种类和比例、渗透压、酶解时间、预处理方式及纯化方法等因素影响植物原生质体的分离。目前有关小花矮牵牛原生质体分离研究较少，Power(1980)等利用4wt％纤维素酶+2wt％半纤维素酶+0.3wt％离析酶分离小花矮牵牛叶片，酶解过程所需时间较长；Meyer(2009)利用2％纤维素酶+0.6wt％离析酶分离经过预质壁分离小花矮牵牛叶片，酶解时间15h，漂浮法纯化原生质体，原生质体产量约为2.3×10⁶个/g，活性可达80％以上。不同物种同一物种不同品种原生质体分离差异较大，有关小花矮牵牛原生质体分离效率不高，且分离时间较长。本发明建立了一套完善的分离体系，分离时间缩短，原生质体产量增加，原生质体纯化方式简便，可重复性好，极大的提高了小花矮牵牛原生质体的分离效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小花矮牵牛(Calibrachoa hybrid‘lindurayellow’)原生质体的制备方法；该制备方法简便，可高效制备原生质体，且可重复性好。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明所提供的制备原生质体的方法，包括以下步骤：

(1)对叶片进行预处理：在黑暗条件下，收集幼嫩叶片于3～5℃清水中进行20～25h预处理；

(2)用酶解液酶解步骤(1)中处理后的叶片；所述酶解液的溶剂为0.25M的磷酸盐溶液，溶质为如下终浓度的物质：2wt％的纤维素酶；0.8wt％的离析酶；0.2wt％的果胶酶；0.11wt％的无水氯化钙；0.10wt％的牛血清白蛋白；所述酶解液的pH值为5.6～5.7；

(3)向步骤(2)的酶解结束后的溶液中加入和所述酶解液等体积的A溶液，轻轻摇晃酶液，经过300目细胞筛过滤后1100r/min离心2min，移液枪吸去上清液；A溶液为CPW洗液，其中溶剂为CPW盐溶液，溶质为终浓度0.25M的甘露醇；

(4)在经过步骤(3)处理的体系中缓缓加CPW洗液洗涤，后在Centrifuge 5810R离心机1100r/min离心2min，吸去上清液，收集沉淀，即得原生质体；

(5)在所述原生质体中缓缓加入悬浮液，得到悬浮的原生质体；所述悬浮液为含0.25M的甘露醇、4mMMES、0.1wt％KCl的水溶液，所述悬浮液的pH为5.6～5.7。

作为优选技术方案，所述幼嫩叶片为顶芽下端第1～2片幼嫩叶片。