[发明专利]一种溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化多级联通液体发酵方法

权利要求书

1.一种溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化多级联通液体发酵方法，其特征是包括以下步骤：

(1)确定蜡样芽孢杆菌CZBC1的多级联通发酵罐培养的发酵培养基；

(2)活化培养：将保种的蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种进行活化培养，得活化的蜡样芽孢杆菌CZBC1；

(3)摇瓶种子液培养：将步骤(2)中活化好的蜡样芽孢杆菌CZBC1置于种子瓶中，恒温振荡培养，得摇瓶种子液；

(4)多级联通发酵罐培养：多级联通发酵罐的大小依次为50L、500L和5000L，每个发酵罐中装有步骤(1)中确定的发酵培养基，首先将摇瓶种子液接种到50L发酵罐中进行发酵培养至菌种浓度达到10⁹cfu/mL以上，接着取50L发酵罐中的种子液接种到500L发酵罐中继续培养至菌种浓度达到10⁹cfu/mL以上，最后取500L发酵罐中的种子液接种到5000L发酵罐中继续培养至芽孢数量达到10¹⁰个/mL以上，且芽孢的获得率达到95％以上时，将发酵液引入离心机；

(5)菌泥制备及载体复合：将发酵液引入离心机离心后，取菌泥，将菌泥与载体混匀后经包括干燥、粉碎、包装和抽检工序处理后，得蜡样芽孢杆菌制剂产品。

2.根据权利要求1所述的溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化多级联通液体发酵方法，其特征是：步骤(1)中确定的蜡样芽孢杆菌CZBC1的发酵培养基为在1L水中含有葡萄糖0.6g～8.5g、糖蜜0.6g～8.5g、酵母膏5～7g、蛋白胨5～7g、大豆蛋白18～23g、NaCl0.8～1.3g、KH₂PO₄0.15～0.3g和MgSO₄0.15～0.3g。

3.根据权利要求1所述的溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体发酵方法，其特征是：步骤(2)中蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种进行活化培养时采用的营养基为营养肉汤固体培养基，营养肉汤固体培养基的pH6.50～7.20，28～30℃温度活化培养18～24h；步骤(3)中恒温振荡培养时采用的培养液为营养肉汤液体培养基，营养肉汤液体培养基的pH6.50～7.20，180～230rpm，28～30℃恒温振荡培养18～24h。

4.根据权利要求1所述的溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化多级联通液体发酵方法，其特征是：步骤(4)中发酵培养基的体积占每个发酵罐总容积的65～70％。

5.根据权利要求1所述的溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化多级联通液体发酵方法，其特征是：步骤(4)中将摇瓶种子液接种到50L发酵罐中进行发酵培养时摇瓶种子液的接种量占发酵培养基总体积的3～5％，发酵培养时间为18～24h；取50L发酵罐中的种子液接种到500L发酵罐中继续培养时种子液的接种量占500L发酵罐中发酵培养基总体积的3～5％，发酵培养时间为18～24h；取500L发酵罐中的种子液接种到5000L发酵罐中继续培养时种子液的接种量占5000L发酵罐中发酵培养基总体积的3～5％。

6.根据权利要求1所述的溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化多级联通液体发酵方法，其特征是：步骤(4)中多级联通发酵罐培养时，每次将种子液接种至发酵罐中进行发酵培养后，取样进行实验室显微镜检查，确认菌种未受杂菌污染，然后再接种入下一发酵罐进行接种培养。

7.根据权利要求1所述的溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化多级联通液体发酵方法，其特征是：步骤(4)中采用无缝联通导管将菌液引入离心机，步骤(5)中将菌液引入离心机离心时，单机单次装载量为4～5kg，离心机转速为12000～15000rpm，离心时间为30～45min，获得菌量超过8×10¹⁰cfu/mL的菌泥。

8.根据权利要求1所述的溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化多级联通液体发酵方法，其特征是：步骤(5)中菌泥与载体的质量比为1:4～6，所述的载体为麸皮、沸石粉或轻质碳酸钙。