[发明专利]尿液处理方法和气相色谱‑质谱检测尿液甲基丙二酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及尿液处理方法和尿液有机酸，特别是尿液甲基丙二酸的检测方法。

背景技术

甲基丙二酸血症(MMA)，又称为甲基丙二酸尿症，是一种常染色体隐性遗传的代谢性疾病，是有机酸血症中最常见的类型。其发病原因是由于甲基丙二酰辅酶A转化为琥珀酰辅酶A的代谢过程中出现障碍，从而导致体内甲基丙二酰辅酶A、甲基丙二酸、丙酸等有机酸蓄积，引发代谢性酸中毒，损害神经系统，严重者可引起酮症酸中毒、低血糖、高血氨、高甘氨酸血症等，新生儿、婴幼儿期的病死率很高。

然而，由于有机酸代谢病临床表现复杂，且症状均为非特异性的，临床诊断较为困难，需要依赖质谱检测技术进行筛查。目前，甲基丙二酸血症的诊断主要采用两种方法：使用串联质谱法检测滤纸干血片酰基肉碱的方法和气相色谱-质谱(GC-MS)联用检测尿液甲基丙二酸的方法。但是，在串联质谱滤纸干血片检测中，即使检测结果显示酰基肉碱的含量升高，患者仍存在患有甲基丙二酸血症或丙酸血症两种病症的可能性，诊断的特异性不高，容易出现误诊或错诊。因此，GC-MS联用检测尿液有机酸的方法是辅助诊断甲基丙二酸血症的主要手段，能够诊断多数的有机酸代谢疾病。

现有技术的GC-MS联用尿液有机酸检测通常包括如下步骤：取一定量的尿样，加入尿素酶去除尿素后加入内标并定容，调节PH值，加入盐酸羟胺进行反应，之后进行酸碱中和，萃取、干燥后进行衍生化反应，以及样品上机进行有机酸检测。检测的仪器条件一般为：

1.GC部分

进样方式：分流模式；

分流比：10:1；

进样口温度：280℃；

升温程序：100℃保持4分钟，以4℃/分钟的升温速率升至280℃，保持11分钟；

流量控制模式：恒线速度。

2.MS部分

离子源温度：200℃；

接口温度：280℃；

采样方式：Scan；

间隔：0.50s；

扫描速度：1000；

开始扫描离子质核比(m/z)：50；

结束扫描离子质核比(m/z)：500。

上述检测方法中，样品上机前的整个前处理周期需要5-6个小时，同时样品分析周期也长，一般需要1小时左右。这么长的前处理和检测周期有可能会延误甲基丙二酸血症患儿的诊断、治疗甚至抢救。

综上，鉴于甲基丙二酸血症在有机酸代谢疾病中的发病率高，会造成患儿不可逆的神经损害等严重后果，串联质谱法滤纸干血片检测的敏感指标与丙酸血症相似，特异性不高，不易确诊；而作为目前主要检测手段的GC-MS联用尿液有机酸检测耗时长，可能会延误最佳治疗时机。因此，需要找到一种快速、准确的检测尿液甲基丙二酸的方法。

发明内容

针对现有串联质谱法滤纸干血片检测和GC-MS联用尿液甲基丙二酸检测方法的缺陷，本发明的目的在于通过简单的尿液前处理方法、以及优化气相色谱和质谱的仪器条件，从而实现尿液甲基丙二酸的快速检测。

本发明提供一种尿液处理方法，包括以下步骤：取一定量的尿样，加入内标及冰冻无水乙醇，充分震荡混合均匀，离心处理去除蛋白，取上清液，氮吹至完全干燥，加入衍生化试剂进行反应。

优选本发明的尿液处理方法中所述一定量的尿样含0.2毫克肌酐。

优选本发明的尿液处理方法中所述内标为托品酸。

优选本发明的尿液处理方法中所述冰冻无水乙醇为2.0ml。

优选本发明的尿液处理方法中所述离心在4000rpm下进行5分钟。

优选本发明的尿液处理方法中所述氮吹在60℃条件下进行。

优选本发明的尿液处理方法中所述衍生化反应使用双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺:三甲基氯硅烷为99:1的硅烷化试剂，在70℃条件下进行。

本发明还提供一种气相色谱-质谱检测尿液甲基丙二酸的方法，包括本发明的尿液处理方法，以及在下述气相色谱和质谱仪器条件下上机检测。

1.气相色谱部分

进样方式：分流模式；

分流比：10:1；

进样口温度：280℃；

升温程序：120℃保持2分钟，以10℃/分钟的升温速率升至180℃，保持1.5分钟

流量控制模式：恒线速度。

2.质谱部分

离子源温度：200℃；

接口温度：280℃；

采样方式：Scan；

间隔：0.50s；

扫描速度：1000；

开始扫描离子质核比(m/z)：50；