[发明专利]一个能特异性识别HBsAg多个抗原表位的单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及能特异性识别HBsAg空间表位的单克隆抗体及其应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种呈广泛性分布、危害较为严重的一种传染性病毒之一，全球已经有将近20亿的人曾经感染过HBV，持续性病毒感染的人达到了3～4亿人。我国是一个HBV感染的大国，持续感染患者达到1亿以上。随着预防免疫接种和高效价免疫球蛋白的应用，在选择压力下，人群中感染HBV变异株的比例越来越高。HBV变异株可能降低抗体检测的敏感性以及预防接种的有效性。因此，病毒变异给HBV预防和治疗带来了很大的困难。鉴于缺少可特异性识别HBsAg空间表位的特异性抗体，针对HBV变异株免疫原性的研究尚不充分。

发明内容

本发明的目的是针对现有不足，提供一株能特异性识别HbsAg特定空间表位的单克隆抗体。

本发明的另一目的是提供能够分泌该单抗的杂交瘤细胞。

本发明的又一目的是提供该单抗的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株杂交瘤细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年9月16日，保藏编号为CCTCC NO:C2014151。

一种能够特异性认别HBsAg第120、122、126、141、147、155位点构成的空间表位的单克隆抗体，由所述的保藏编号为CCTCC NO:C2014151的杂交瘤细胞分泌。

保藏编号为CCTCC NO:C2014151的杂交瘤细胞在制备乙型肝炎病毒检测试剂中的应用。

本发明所述的单克隆抗体在制备乙型肝炎病毒检测试剂中的应用。

本发明所述的杂交瘤细胞的制备方法：

(1)构建DNA疫苗：密码子优化SEQ ID NO.1所示的HBsAg氨基酸序列的编码序列(HBsAg-Wt)，获得基因序列SEQ ID NO.2；将SEQ ID NO.2所示的优化的HBsAg基因序列克隆入真核表达载体pJW4303的HindIII/BamHI酶切位点间得到DNA疫苗HBsAg-Opt，用于小鼠体内免疫和体外转染293T收集抗原进行单克隆抗体的筛选；

(2)用DNA疫苗免疫小鼠，提取脾细胞与骨髓瘤细胞融合或的杂交瘤细胞；

(3)按照以下方法对上一步获得的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行筛选：

①定点诱变SEQ ID NO.2所示的优化的HBsAg基因，将其克隆到真核表达载体pJW4303的HindIII/BamHI酶切位点间，制备HBsAg基因变异表达质粒(22株)；将HBsAg基因变异表达质粒(22株)分别转染293T细胞，进一步在体外进行表达并收集抗原，用于筛选HBsAg特定表位的单克隆抗体；

②HAT选择培养基培养杂交瘤细胞，10天后取上清进行ELISA检测；选择OD值在1.0以上，并且孔内细胞形态及活力好的孔位进行下一步的筛选；

③利用步骤①中制备的HBsAg变异株表达上清对杂交瘤所分泌的单克隆抗体的位点特异性进行检测，筛查识别空间表位的单抗。

其中，定点诱变SEQ ID NO.2所示的优化的HBsAg基因的表达产物分别在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第118、120、122、123、126、130、133、141、142、143、145、146、147、154、155、181、204等氨基酸残基处发生了点突变。

有益效果：

按照哺乳动物的密码子偏好原则，本专利优化编码HBsAg基因的DNA序列，并制备DNA疫苗，其益处有二：(一)DNA疫苗在体内转录翻译生成蛋白质，有利于保存抗原空间表位；(二)密码子优化提高了DNA疫苗的蛋白质表达效率，克服了DNA疫苗免疫原性弱的缺陷。

DNA疫苗常规接种方式有皮下注射、肌肉注射等等。不同于常规接种方法，本专利应用大剂量瞬时尾静脉注射方法，DNA疫苗第一时间进入肝脏，目的基因体内转染的靶器官主要是肝脏。本专利的体内转染方式能有效模拟HBV感染肝脏的过程。

为有效获得HBsAg空间表位的单克隆抗体，本发明定点诱变HBsAg表达疫苗，并在体外生产并获得变异蛋白22株，通过对HBsAg特定表位的单克隆抗体检测结果进行比对分析，确定其中一株能特异性认别HBsAg第120、122、126、141、147、155位点氨基酸构成的空间表位，获得特异性识别HBsAg空间表位的单克隆抗体。