[发明专利]一种固定化马来酸顺反异构酶及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种固定化马来酸顺反异构酶及其制备方法与应用，属于酶学与酶工程技术领域与生物化工领域。本发明将R5肽段连接在马来酸顺反异构酶的N端，再将R5‑MaiA用戊二醛交联，最后用硅反应液将交联后的R5‑MaiA进行包埋，完成马来酸顺反异构酶的固定化。用成本低、易操作的方法获得了稳定性高的固定化马来酸顺反异构酶(R5‑MI‑CLEA‑Si)，固定化酶最适反应温度为55℃，最适反应pH为7.7；在55℃条件下固定化酶的半衰期为4h，游离酶的半衰期为0.5h，固定化酶的稳定性是游离酶的8倍，重复催化反应8次后固定化酶的酶活仍能保留75％。

技术领域

本发明涉及一种固定化马来酸顺反异构酶及其制备方法与应用，属于酶学与酶工程技术领域与生物化工领域。

背景技术

目前，工业生产富马酸以化学合成法为主，包括糠醛氧化法和顺丁烯二酸酐异构法等。但是化学合成法需利用石油资源，而石油是不可再生资源促使生产成本增高，并且还有污染大等缺点。随着技术的发展，以微生物发酵法和酶转化法为主的生物合成法正逐渐取代化学合成法，但是微生物发酵法会产生大量的发酵副产物，不利于产品的分离提纯。酶法有转化率高、产物单一、催化pH单一的优点，是工业生产富马酸很有潜力的方法。

酶作为生物催化剂，近年来在食品生产与检测、生物技术等领域受到广泛关注。但是由于价格昂贵、稳定相差、反应后难以回收等缺点的限制，使其很难被开发和应用，但是相对于游离酶，固定化酶就具有较高的稳定性、在反应系统中易分离、可重复利用、利于实现自动化生产等优点。

常规固定化方法有吸附法、共价结合法、包埋法等，在吸附过程中材料与酶分子会发生多种相互反应，有些反应会使酶分子形成不稳定结构从而使酶失活，物理吸附和共价交联都能够减少和避免酶的渗漏，但是酶在结合到材料的二维表面后可能导致活性降低甚至是失活。多聚体酶，例如马来酸顺反异构酶，在解聚后获得的单亚基不具有活性从而使酶失活，这是多聚体酶在固定化时面临的一个很重要的难题，也是影响固定化效果的重要原因。

发明内容

本发明的目的是提供一种固定化马来酸顺反异构酶的制备方法，是通过交联-包埋马来酸顺反异构酶，得到固定化酶。

所述交联-包埋马来酸顺反异构酶，是在马来酸顺反异构酶的N端融合SEQ IDNO.1所示核苷酸序列编码的R5短肽，所得重组酶与交联剂交联获得交联酶聚集体，再与硅化反应液、正硅酸甲酯混合剧烈搅拌，得到固定化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述马来酸顺反异构酶来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。

在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主，以pET24a为载体，重组表达获得N端融合有R5短肽的重组马来酸顺反异构酶。

在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主，以pET24a为载体，构建重组表达N端融合有R5短肽的重组马来酸顺反异构酶的重组菌，培养收集重组菌并破壁后，上清液经硫酸铵沉淀后用于制备固定化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述交联剂为10％的戊二醛。

在本发明的一种实施方式中，所述硅化反应液是pH＝8的含0.1M磷酸氢二钾和0.1M氢氧化钠的溶液。

在本发明的一种实施方式中，交联酶聚集体与硅化反应液、正硅酸甲酯按体积比1:8:1混合。

本发明的一种实施方式包括以下步骤：

步骤1：将R5短肽与马来酸顺反异构酶N连接，并构建表达融合蛋白R5-MaiA的工程菌株；

步骤2：取步骤1工程菌的发酵液离心去上清后获得菌体，用缓冲液清洗菌体并调整菌液OD₆₀₀＝30-40，超声波破碎后离心取上清；