[发明专利]一种无蛋白、无水解物的无血清培养基及其制备方法

说明书

本发明涉及一种无蛋白、无水解物的无血清培养基及其制备方法，该培养基包含有：葡萄糖酸锰、柠檬酸苹果酸钙、依地酸二钠、孕酮、丙谷二肽、β甘油磷酸钠、果糖、维生素C、维生素E、亚硒酸钠、羟丙基‑β‑环糊精、胆固醇、苹果酸、草酰乙酸、维生素B12、硫辛酸、硫酸亚铁、柠檬酸铁、尿酸、牛磺酸、还原型谷胱甘肽、硫酸锌、硫酸铜和硝酸铁等物质，本发明提供的培养基具有成本低、产品批间差异小，简化了下游产品的纯化步骤，降低安全隐患等优点。

技术领域

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种无蛋白、无水解物的无血清培养基及其制备方法，特别涉及一种适用于PK15细胞贴壁培养的无蛋白、无水解物的无血清培养基及其制备方法。

背景技术

无血清细胞培养是体外细胞代谢研究的基础，也是生物制品领域、干细胞治疗领域常见的技术手段之一。现有的用于动物细胞无血清培养的培养基绝大部分需要加入胰岛素、转铁蛋白、白蛋白等蛋白类组分，这些组分虽然具有极佳的细胞生长促进效果，但是与无蛋白细胞培养基相比：其成本高昂；下游产品的纯化更加复杂化；并且，其中可能携带的外源病毒会带来严重的安全隐患。

PK15细胞来源于猪肾，中文名为猪肾上皮细胞，正常的细胞形态为上皮样，贴壁生长。该细胞对多种病毒敏感，如猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)等，可应用于猪圆环病毒疫苗、猪细小病毒疫苗、猪瘟病毒疫苗等疫苗的制备。目前，培养PK15细胞生产疫苗的主要是转瓶工艺，培养基为基础培养基DMEM、199或MEM+10％牛血清。牛血清作为疫苗生产原料有其明显的缺点：价格昂贵、成分难以明确、产品批间差异不易控制，并且要求极其严格的检测程序以确保血清中不含有血清来源动物可能携带的细菌、病毒等。同时，PK15细胞也是体外细胞代谢研究的模型之一，培养基中的蛋白水解物、血清等不明确组分会对研究结果产生干扰。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种无蛋白、无水解物的无血清培养基及其制备方法，并针对PK15细胞，优化该培养基。

为解决上述技术问题，首先，本发明公开了一种无蛋白、无水解物的无血清培养基，组分如下：

其中，果糖可以提供碳源，其吸收利用率比较低，有利于维持培养液PH的稳定性；孕酮为激素类营养，可以刺激细胞分裂，促进细胞增殖；亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸为细胞提供脂肪酸营养。

进一步，无蛋白、无水解物的无血清培养基的制备方法为，将5～30mg吐温80溶解于50毫升注射用水中，依次加入0.0003～0.05mg亚油酸、0.0005～0.07mg亚麻酸、0.0001～0.02mg花生四烯酸，待其溶解充分，用注射用水补液至500毫升，再依次加入5～7g氯化钠、1～6g葡萄糖、0.5～5g果糖，搅拌至澄清，用注射用水补液至900毫升，然后依次加入：

搅拌至完全溶解，用注射用水补液至1000毫升，4℃避光保存。

优选的，从成本和达到相似的效果方面考虑，本发明的一种优选方案为：

进一步，为了制得更适于PK15细胞贴壁培养的培养基，还需在上述配方中，添加下列组分：50～500mg/L的羟丙基-β-环糊精、0.2～110mg/L的β甘油磷酸钠、0.5～5mg/L的硫酸亚铁、0.5～34mg/L的依地酸二钠、10～120mg/L的柠檬酸苹果酸钙、5～140mg/L的柠檬酸铁，80～700mg/L的丙谷二肽、0.5～8mg/L的尿酸、0.5～10mg/L的还原型谷胱甘肽、0.0001～0.06mg/L的葡萄糖酸锰、6～210mg/L的草酰乙酸、4～140mg/L的苹果酸和0.5～250mg/L的牛磺酸。