[发明专利]一种脂肪酶及其应用

说明书

技术领域

本发明属于功能酶技术领域，具体涉及一种脂肪酶及其应用。

背景技术

脂肪酶(LipaseE.C.3.1.1.3)是一类特殊的界面酯酶，能够水解甘油三酯的酯键产生脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯及甘油，其天然底物一般是不溶于水的长链脂肪酸酰基酯。在非水反应体系中脂肪酶还能够催化其逆反应，发生酯化反应、酯交换反应、醇解反应、酸解反应以及氨解反应等。微生物脂肪酶由于其种类多、生产周期短、便于结构修饰，且相比动植物脂肪酶具有更加广泛的温度、pH适应性，广泛的底物特异性，高度的位置选择性和异构体选择性，催化活性高，副反应少等特点使其广泛应用于食品加工、新型生物材料、生物传感器、生物医学、手性药物拆分等领域。同时微生物脂肪酶催化的条件温和性和环境友好性，已经改变了传统的酯化或转酯化反应所需要的高温、强酸、强碱等相对苛刻的条件，在提高生产效率的同时减少了对环境的污染，所以从自然界中筛选具有特异性活力的脂肪酶是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种脂肪酶及其应用，即从寡养单胞菌发酵粗酶液中分离纯化的脂肪酶，从而弥补现有技术的不足。

本发明的脂肪酶，包含有：

1)氨基酸序列为SEQIDNO:1的多肽，

2)与1)中的多肽具有85％以上序列同一性，且具有1)中酶学功能的，由1)所衍生的多肽。

作为优选，所述的2)中的多肽与1)中的多肽具有90％以上序列同一性；更进一步的，具有95％以上序列同一性。

本发明还提供编码上述脂肪酶的核酸，其一种具体的序列为SEQIDNO:2；

上述的脂肪酶是从寡养单胞菌中分离纯化得到，其SDS-PAGE电泳分子量大小为22kDa。

上述的脂肪酶，Fe³⁺和SDS能够完全抑制酶活，Cu²⁺，Zn²⁺，Al³⁺，Mn²⁺以及H₂O₂(1％，v/v)，Phenol(5％，w/v)能够部分抑制酶活。

上述的脂肪酶，其最适的pH为7-8；在pH5-12的范围内4℃放置过夜能够保持80％以上的活力。

上述的脂肪酶，其最适的反应温度为40℃；在10-40℃范围内放置1h能够维持80％以上的活力。

本发明还提供一种重组微生物，用于重组表达上述的脂肪酶。

本发明脂肪酶用于以甘油和DHA乙酯为底物转酯合成DHA甘油酯。

相比较于现有的利用脂肪酶催化法制备DHA产品的工艺：EPA浓缩油和DHA浓缩油的制造方法(CN101765662A)、一种脂肪酶催化合成鱼油乙酯的方法(CN101979622A)、高纯度DHA藻油乙酯及其转化为甘油酯的制备方法(CN103880672A)，利用本发明的脂肪酶合成的DHA甘油酯不含饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸等低效成分，合成产物中甘油酯含量高，且催化合成过程时间短，在产品品质和合成效率方面具有较明显的优势。

附图说明

图1：本发明的脂肪酶纯化过程电泳图；其中泳道1为蛋白Marker，泳道2为SephadexG-75分离样品，泳道3为DEAESepharoseFastFlow分离样品，泳道4为80％硫酸铵沉淀透析液，泳道5为发酵粗酶液。

图2：本发明的脂肪酶最适pH及pH稳定性示意图；1为最适pH示意图，2为pH稳定性示意图。

图3：本发明的脂肪酶最适温度及温度稳定性示意；1为最适温度示意图，2为温度稳定性示意图。

图4：本发明克隆脂肪酶基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；泳道1为PCR扩增产物，泳道2为DNAMarker。

图5：本发明脂肪酶的重组表达电泳示意图；泳道1为蛋白Marker，泳道2为镍柱纯化蛋白，泳道3为重组表达粗酶液。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的酶的分离纯化、酶学性质、克隆表达及应用进行详细的描述。

实施例1：LH15脂肪酶的分离纯化