[发明专利]双重定量蛋白毒素量子点荧光免疫层析试纸条及制备方法

权利要求书

1.双重定量蛋白毒素量子点荧光免疫层析试纸条，包括作为基材的黑色长条状聚氯乙烯背板，其特征在于，在沿背板长度方向在其表面依次布置样品垫、量子点抗体标记物固定垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，相邻垫或膜间彼此搭接；在硝酸纤维素膜上，设有与背板同宽的彼此间隔的两条检测线和一条质控线，其中质控线位于吸水垫一侧；在量子点抗体标记物固定垫上，以喷涂、敷涂或浸泡的方式固定有蛋白类毒素特异性单克隆抗体与羧基修饰水溶性量子点标记复合物；所述质控线是将山羊抗鼠多克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成，所述检测线是将待检蛋白类毒素多克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成，两条检测线所含蛋白类毒素多克隆抗体是不同的。

2.根据权利要求1所述的量子点荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述量子点抗体标记物固定垫上的蛋白类毒素特异性单克隆抗体与羧基修饰水溶性量子点标记复合物，其制备方法是：

以浓度为0.01M、pH＝7.4的硼酸盐缓冲液分别配置偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，浓度均为10mg/ml；取50μl羧基修饰的水溶性量子点至2ml EP管，加200μl浓度为0.05M、pH＝6的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，并根据水溶性量子点上羧基的摩尔数量加入EDC和NHS溶液；室温摇床活化30min后15000rpm离心30min弃上清，加入1ml含5μg特异性蛋白类毒素单克隆抗体的0.05M、pH＝6的MES缓冲液；室温摇床反应2h后15000rpm离心30min弃上清，并用1ml 0.01M、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液重悬，离心，洗去未反应的抗体；重复上述重悬、离心操作三次；最终加100μl的0.05M、pH＝8.0的硼酸盐缓冲液作为保存液，得到蛋白类毒素特异性单克隆抗体与羧基修饰水溶性量子点标记复合物，在4℃放置，备用。

3.根据权利要求1所述的量子点荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述蛋白类毒素单克隆抗体和多克隆抗体所对应的蛋白类毒素是金黄色葡萄球菌A型肠毒素、金黄色葡萄球菌B型肠毒素、金黄色葡萄球菌C型肠毒素、产气荚膜梭菌E型肠毒素或蜡样芽孢杆菌肠毒素FM蛋白中的任意一种。

4.根据权利要求1至3任意一项中所述的量子点荧光免疫层析试纸条，其特征在于，该试纸条的宽度为0.4cm，样品垫、量子点抗体标记物固定垫、硝酸纤维素膜和吸收垫的长度分别为1.7cm、0.8cm、2.5cm、1.7cm；其中，样品垫与量子点抗体标记物固定垫的搭接重合长度为0.2cm，量子点抗体标记物固定垫与硝酸纤维素膜的搭接重合长度为0.2cm，硝酸纤维素膜与吸收垫的搭接重合长度为0.3cm；在硝酸纤维素膜上，两条检测线及质控线之间的间距分别为0.4cm、0.4cm。

5.制备权利要求1所述量子点荧光免疫层析试纸条的方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)制备量子点抗体标记物固定垫

以浓度为0.01M、pH＝7.4的硼酸盐缓冲液分别配置偶联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，浓度均为10mg/ml；取50μl羧基修饰的水溶性量子点至2ml EP管，加200μl浓度为0.05M、pH＝6的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，并根据水溶性量子点上的羧基摩尔数量加入EDC和NHS溶液；室温摇床活化30min后15000rpm离心30min弃上清，加入1ml含5μg特异性蛋白类毒素单克隆抗体的0.05M、pH＝6的MES缓冲液；室温摇床反应2h后15000rpm离心30min弃上清，并用1ml 0.01M、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液重悬，离心，洗去未反应的抗体；重复上述重悬、离心操作三次；最终加100μl的0.05M、pH＝8.0的硼酸盐缓冲液作为保存液，得到蛋白类毒素特异性单克隆抗体与羧基修饰水溶性量子点标记复合物，在4℃放置，备用；

以喷涂、敷涂或浸泡的方式，将蛋白类毒素特异性单克隆抗体与羧基修饰水溶性量子点标记复合物固定在量子点抗体标记物固定垫上，在37℃干燥2小时备用；

(2)检测线与质控线的喷涂：取硝酸纤维素膜贴于作为基材的长条状聚氯乙烯背板上，点膜仪在硝酸纤维素膜上同时喷涂两条检测线和一条质控线，其中质控线位于一侧；质控线的喷涂液为山羊抗鼠多克隆抗体，两条检测线的喷涂液是不同种类的待检蛋白类毒素多克隆抗体；在37℃干燥2小时后，置于聚乙二醇溶液中浸泡30分钟，晾干后在37℃干燥2小时备用；

(3)免疫层析试纸条的组装：将样品垫、量子点抗体标记物固定垫和吸收垫布置于聚氯乙烯背板上，并使样品垫、量子点抗体标记物固定垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次排列，硝酸纤维素膜的质控线位于吸水垫一侧，且相邻垫或膜间彼此搭接；将聚氯乙烯背板及其贴附的材料切成4mm宽的层析条，将层析条放入塑料板卡内，用压卡机压实。