[发明专利]一种单个细胞筛选的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及单个细胞筛选的方法及其应用。

背景技术

传代细胞在生命科学方面用途非常广，是新药筛选、基因工程药物和细胞工程药物研究与开发领域的重要的研究对象，同时在疫苗和单克隆抗体的制备方法有着不可或缺的作用，如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。

传代细胞是由原代细胞基础上通过胰酶等物质消化后继续用于细胞培养的细胞，它与原代细胞具有相同核型。这类细胞在体外可以无限制分裂。但是传代细胞含有很多不同类型的细胞。不同类型的细胞生物学特性不一样，在生物制品生产过程同一种传代细胞都表现出不同的性能，例如在病毒或生物活性物质产量方面存在差异等。因此，筛选性能好的细胞非常重要，在单抗筛选过程中更为重要，怎么样更好更快的筛到单个克隆细胞是筛选到制备合格单抗克隆抗体先决条件之一。

目前，单个细胞筛选的方法主要梯度稀释方法。但是这种方法存在如下困难：1)细胞稀释梯度低时，每个96孔中细胞量非常多；2)细胞稀释梯度高很容易出现每个96孔没有细胞的情况；同时稀释梯度高，例如当细胞为0.5-10个/毫升时，由于细胞数量少和细胞分布于培养液中不同位置，造成很难在显微镜下观察到并且计数。这也是造成细胞稀释梯度高很容易出现每个96孔没有细胞的情况的根本原因。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种快速获得大量、均一的单个细胞筛选的方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种单层细胞筛选方法，包括以下步骤：

1)初步分散：取消化分散的贴壁细胞或悬浮细胞，用无血清培养基稀释100-1000倍，取出250-500μL移至25cm²培养瓶，晃动，使细胞均匀分布于培养瓶中；

2)辅助分散：用40倍显微镜观察细胞分布情况，轻轻晃动培养瓶直到细胞均匀分布于细胞瓶中；

3)计数稀释：采用40倍镜显微镜，随机选5个视野，计算每个视野中细胞数量并计算平均数，晃动或稀释调整至每个视野中细胞平均数量为1-3，用无血清培养基稀释200-500倍，得细胞液；

4)培养液配制：向50mL无血清培养基中加入10-20mL血清，加无血清培养基定容至100mL，得培养液；

5)培养：取250-500μL步骤3)所得的细胞液，加入20-40mL步骤4)所得的培养液，混匀，以100-200μL细胞液/孔的量转移至96孔细胞培养板，培养。

作为优选，包括以下步骤：

1)初步分散：取消化分散的贴壁细胞或悬浮细胞，用无血清培养基稀释400-500倍，取出400-500μL移至25cm²培养瓶，晃动，使细胞均匀分布于培养瓶中；

2)辅助分散：用40倍显微镜观察细胞分布情况，轻轻晃动培养瓶直到细胞均匀分布于细胞瓶中；

3)计数稀释：采用40倍镜显微镜，随机选5个视野，计算每个视野中细胞数量并计算平均数，晃动或稀释调整至每个视野中细胞平均数量为1-3，用无血清培养基稀释300-400倍，得细胞液；

4)培养液配制：向50mL无血清培养基中加入10mL血清，加无血清培养基定容至100mL，得培养液；

5)培养：取400-500μL步骤3)所得的细胞液，加入20mL步骤4)所得的培养液，混匀，以100μL细胞液/孔的量转移至96孔细胞培养板，培养。

作为优选，包括以下步骤：

1)初步分散：取消化分散的贴壁细胞或悬浮细胞，用无血清培养基稀释500倍，取出500μL移至25cm²培养瓶，晃动，使细胞均匀分布于培养瓶中；

2)辅助分散：用40倍显微镜观察细胞分布情况，轻轻晃动培养瓶直到细胞均匀分布于细胞瓶中；

3)计数稀释：采用40倍镜显微镜，随机选5个视野，计算每个视野中细胞数量并计算平均数，晃动或稀释调整至每个视野中细胞平均数量为1-3，用无血清培养基稀释300倍，得细胞液；

4)培养液配制：向50mL无血清培养基中加入10mL血清，加无血清培养基定容至100mL,得培养液；

5)培养：取500μL步骤3)所得的细胞液，加入20mL步骤4)所得的培养液，混匀，以100μL细胞液/孔的量转移至96孔细胞培养板，培养。

作为优选，所述无血清培养基为不含血清的RPMI 1640或DMEM培养基。