[发明专利]一种重组人胰岛素的工业制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体是指一种重组人胰岛素的工业制备方法。

背景技术

随着生物技术的迅猛发展，基因工程重组人胰岛素面世，较动物来源胰岛素优势更加明显，与人体内胰岛素的序列完全一致，且纯度更高，含宿主蛋白少，安全无毒副作用。

现有的人胰岛素的制取方法，工序复杂，对原料及设备要求较高，无法适应批量化生产的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组人胰岛素的工业制备方法，简化工艺流程，提高生产效率，改进产品品质，适应工业制备需求。

本发明通过下述技术方案实现：一种重组人胰岛素的工业制备方法，包括以下步骤：

步骤S100：制备菌种；

步骤S200：培养菌种；

步骤S300：包涵体的收集；将培养的菌种在-20℃以下冻干，然后用缓冲液A溶解，室温状态下振荡2-4h，固液分离后收集沉淀，得包涵体；

步骤S400：RRhPI初步纯化；将收集的包涵体用缓冲液B完全溶解后，再以缓冲液B与缓冲液C体积比为1:2-1:10添加缓冲液C，使蛋白浓度为0.05-0.5mg/ml，然后上于已用缓冲液B平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用NaCl梯度洗脱，收集含RRhPI的洗脱液；

步骤S500：RRhPI重组复性；初步纯化后的RRhPI通过Sephadex G-25脱尿素，再转换到缓冲液D中，4℃放置18h以上，得RRhPI复性液；

步骤S600：酶切转化；按胰蛋白酶、羧肽酶B、蛋白的质量比为2:1:2000，向RRhPI复性液中加入胰蛋白酶和羧肽酶B，室温酶切50-80min，然后用0.1mol/L ZnCl2 终止反应并沉淀生成hI；

步骤S700：hI的纯化；hI的纯化包括粗纯化和精纯化；所述粗纯化时，将步骤S600中的hI通过预置8-12mmol/L的Tris-HCl和0-1.0mmol/L的NaCl的两步柱层析，对hI进行初步提纯得到粗品；所述精纯化时，用10-20mmol/L的色谱乙腈对粗品进行精制得到精品；

步骤S800：hI成品；精品再经多次结晶和水洗后进入过滤除菌室，-20℃以下冻干，得到hI成品；

所述步骤S100具体是指：

步骤S110：以人胰腺cDNA文库为模板，用PCR扩增技术提取目的基因；

步骤S120：从用细胞工程培养的大肠杆菌中通过碱裂解法提取环装的pQE-40质粒；

步骤S130：分别取出目的基因和pQE-40质粒，分别利用限制性内切酶Bam HI和Hind III同时酶切并产生粘性末端；

步骤S140：在20℃以下，T4DNA连接酶的作用下，将目的基因与pQE-40质粒结合通过粘性末端互补，形成一个能表达胰岛素的重组DNA；

步骤S150：将含有目的基因的重组DNA放入大肠杆菌的培养液中并加入氯化钙，使大肠杆菌将重组DNA吸收，重组DNA转化E.coli感受态细胞M15；

所述步骤S200具体是指：

步骤S210：取出步骤S100中制备的菌种进行活化；

步骤S220：采用二级发酵方式，恒温振荡2-3h；

步骤S230：用0.5mmol/L的IPTG诱导RRhPI/pQE40 E.coli M15菌种表达RRhPI。

进一步地，所述步骤S210具体是指：取RRhPI/pQE40 E.coli M15斜面菌种一环接种于PH值为6.8-7.6的培养基中，室温条件下以200-280rpm的速度进行振荡培养，通气量为1:1.3-1:1.6；所述培养基的主要成分为3-8g/L胰蛋白胨，1-3g/L谷氨酸，6-8g/L酵母浸膏，0.1-1.0g/L硫酸铵，2-3g/L葡萄糖，2-3g/L甘油，90-110mg/L氨苄青霉素，40-60mg/L卡那霉素。

进一步地，所述培养基的最优配比为5g/L胰蛋白胨，2g/L谷氨酸，7g/L酵母浸膏，0.5g/L硫酸铵，2.5g/L葡萄糖，2.7g/L甘油，100mg/L氨苄青霉素，50mg/L卡那霉素；所述培养基用NaOH调节PH值至7.2。

进一步地，所述步骤S300中缓冲液A的主要成分为40-60mmol/L Tris-HCl，0.2-0.8mmol/L EDTA，40-60mmol/L NaCl，5%甘油，0.1-0.5mmol/L DTT；所述缓冲液A的PH值为7.8-8.2。