[发明专利]以淀粉为原料制备葡萄糖‑1‑磷酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种磷酸葡萄糖的制备方法，具体涉及一种以淀粉为原料制备葡萄糖-1磷酸的方法。

背景技术

葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)广泛存在于动植物以及微生物中，在生物体中起着重要的作用。G-1-P是糖原等多糖降解的第一个产物，可以在葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)的作用下生成葡萄糖-6-磷酸，进入EMP途径；也可以在核酸二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的催化下合成核酸二磷酸葡萄糖(NDP-glucose)，进一步用于各种糖苷的合成等。G-1-P在医药、食品方面应用广泛，它能明显阻止脂肪肝浸润，促进骨骼及牙齿中钙的累积，以及增强钙在哺乳动物小肠内的主动运输。此外，G-1-P还可以用作抗菌剂，其铂螯合物更可用于癌症的治疗；壳聚糖/G-1-P即型水凝胶可以作为创面止血材料及药物缓释材料。

用于生产G-1-P的葡聚糖磷酸化酶可以从土豆中提取，以可溶性淀粉为原料(National Academy Science Letters 2013,36(2):133-137)。微生物是葡聚糖磷酸化酶的最主要来源，微生物产酶具有产量高、易分离等优点。1979年，Werner等人对Physarum polycephalum中的α-葡聚糖磷酸化酶进行分离纯化并对酶学性质进行表征。该酶为糖原磷酸化酶，最适温度为30℃，最适pH为6.7。在磷酸解方向，G-1-P与鸟苷二磷酸葡萄糖对反应有抑制作用，而5’-AMP则有微弱的促进作用，可以中和G-1-P的抑制作用(European Journal of Biochemistry.1979,102:345-355)。1998年，Takata等人对嗜热脂肪芽孢杆菌中的葡聚糖磷酸化酶进行研究，发现其最适温度为50℃(Journal of Fermentation and Bioengineering 1998,85(2):156-161)。由于耐高温酶具有反应速率高、不易染菌、酶稳定性好等优点，在工业应用中占有极大优势。2005年，Jungdon等人将Thermus caldophilus中编码葡聚糖磷酸化酶的基因进行克隆，在E.coli中表达，将重组葡聚糖磷酸化酶分离纯化，并对酶学性质进行表征。此重组酶的最适pH为7.0，最适温度为70℃，在低于70℃时酶较稳定，而当温度高于80℃时，酶活迅速下降。以可溶性淀粉为原料，在70℃下生产G-1-P，底物转化率达68.78％，是目前报道的以葡聚糖磷酸化酶催化制备G-1-P的最高值(Process Biochemistry 2005,40:3707–3713)。

目前所有的葡聚糖磷酸化酶研究中均采用可溶性淀粉为底物，而可溶性淀粉生产工艺较复杂，价格是普通淀粉的3-4倍，不适合G-1-P的大规模生产。如果能以廉价的普通淀粉代替可溶性淀粉直接用作酶催化产G-1-P的原料，则有望显著降低原料成本。目前，国内外未见有关普通淀粉制备G-1-P的报道，主要原因可能是普通淀粉在常温下不能完全糊化，很难直接利用。而目前已报道的用于合成G-1-P的葡聚糖磷酸化酶中，最高温度为70℃。一般而言，常见淀粉的糊化温度为60-70℃，完全糊化温度为65-75℃，若反应温度为70℃，不能保证淀粉完全糊化。且70℃时各淀粉的粘度较高，如5％玉米淀粉及马铃薯淀粉粘度分别为420cp及880cp。在70℃下反应，则造成底物与酶接触不充分，不利于反应进行。所以若要有效地利用淀粉，需要寻找一种反应温度更高的酶，使淀粉完全糊化，体系粘度降低。

发明内容

本发明的目的是针对G-1-P现有的生产原料价格昂贵的问题，提供一种利用廉价易得的普通淀粉生产G-1-P的方法，本发明具有原料成本低、转化率高、G-1-P产量高等优点。

一种以淀粉为原料制备葡萄糖-1-磷酸的方法，包括如下步骤：

(1)将编码葡聚糖磷酸化酶的基因经稀有密码子优化后连接到质粒上构建重组质粒，再将重组质粒转化到宿主菌中构建重组菌；诱导表达所得重组菌；

(2)将诱导表达后的重组菌离心、收集菌体，制备重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液；

(3)将所得重组葡聚糖磷酸化酶纯酶液加入淀粉与缓冲液的混合溶液中，85-90℃下反应，得葡萄糖-1-磷酸；所述淀粉为木薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉或小麦淀粉。

步骤(1)中所述质粒为pET-28a(+)；所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)；因此步骤(1)进一步优选为：