[发明专利]羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的应用

说明书

羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的应用，涉及植物分子生物学领域。该应用方法包括以下步骤：(1)将羊草几丁质酶LcChi2基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的重组载体；(2)将步骤(1)获得的重组载体转化宿主植物细胞，经过筛选获得转化细胞；(3)将步骤(2)获得的转化细胞培育成具有耐冷性的转LcChi2基因植株及其后代。步骤(1)中，所述载体为植物表达载体pBI121或植物表达载体pCAMBIA3300。通过实验证实了转LcChi2基因烟草在冷环境下其种子萌发率有了明显提高，双子叶植物烟草和单子叶植物玉米、水稻过表达LcChi2基因都显著提高了植物苗期耐冷性，从而证明了过表达LcChi2基因显著提高了烟草、玉米、水稻等植物的耐冷能力。

技术领域

本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及一种羊草几丁质酶LcChi2基因在提高植物耐冷性方面的应用。

背景技术

羊草(Leymus chinensis Trin或Aneurolepidium chinense Trin)，别名碱草，禾本科赖草属多年生草本植物。羊草叶量多、营养丰富、适口性好，各类家畜一年四季均喜食，有“牲口的细粮”之美称。羊草具有耐盐碱、耐寒、耐旱、抗真菌、抗细菌等优势，在平原、山坡、沙壤土中均能适应生长。羊草的耐盐碱性非常强，其体内含有许多抗性相关蛋白，是克隆抗逆基因的良好材料。

几丁质酶(chitinase)主要水解几丁质多聚体中的β-1,4糖苷键，产生N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体。根据几丁质酶催化区氨基酸序列的同源性，可以把几丁质酶分为18，19，20家族。18家族的几丁质酶来源于细菌，真菌，病毒及一些植物；19家族的几丁质酶主要包括植物几丁质酶和部分链霉菌属的几丁质酶；20家族包括链霉菌属和人类的几丁质酶。多种微生物、动植物都可产生几丁质酶，高等植物本身不含有作为真菌细胞壁组分之一的几丁质，但当植物受到真菌、细菌和病毒等感染时，几丁质酶的活性迅速提高，几丁质酶在高等植物中有多个成员，功能差异显著。现已证实几丁质酶是主要的植物病程相关蛋白之一。Hong et al的研究表明，病原诱导几丁质酶表达过程中脱落酸(ABA)、NaCl和干旱等因素也有着重要的作用(HONG J K，HWANG B K。Induction by pathogen，salt and drought of abasic class Ⅱ chitinase mRNA and its in situ localization in pepper(Capsicumannuum)[J]。Physiologia Plantarum，2002，114(4):549-558)。Schneider et al的进一步研究发现，病原和水杨酸诱导的几丁质酶活性上升与植物体内的Ca²⁺密切相关(SCHNEIDERMS，KUROSAKI F，NISH IA。Role of salicylic acid and intracellular Ca² in theinduction of chitinase activity in carrot suspension culture[J]。Physiologicaland Molecular Plant Pathology，1994，45(2):101-109)。1986年Schlumbaum et al首次报道了提纯的菜豆几丁质酶具有抗真菌活性(SCHLUMBAUM A，MAUCH F。Plant chitinasesare potent inhibit ors of fungal growth[J]。Nature，1986，324(4376):365-367)。进一步研究表明，提纯的烟草、马铃薯、黄瓜等多种植物几丁质酶对立枯丝核菌等20多种病原真菌和非病原真菌的菌丝生长或孢子萌发具有抑制作用，除抗真菌外，几丁质酶对细菌、昆虫、螨等也表现出一定的抗性。