[发明专利]一种甘蔗无载体框架转基因方法

权利要求书

1.一种甘蔗无载体框架转基因方法，包括以下步骤：

1）质粒提取：对含有bar基因的大肠杆菌单菌落进行培养，提取含有bar基因的质粒；

2）Bar基因表达盒的制备：

采用核酸内切酶Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切步骤1）获得的含有bar基因的质粒，得酶切产物；将酶切产物进行电泳纯化，收集含有启动子、bar基因和终止子的Bar基因表达盒；bar基因目的片段的浓度为100ng/μL；

3）基因枪转化：将步骤2）获得的Bar基因表达盒制备DNA微弹，轰击前愈伤组织的培养，用装载有DNA微弹的基因枪轰击甘蔗叶片愈伤组织，对轰击后的愈伤组织进行培养，具体操作如下：

其中，制备DNA微弹如下：

取4℃保存的60 mg/mL的金粉悬浮液100 µL，从步骤2）获得的Bar基因表达盒内取样20µL，依次加入2.5 mol/L的CaCl₂ 100 µL和0.1 mol/L的亚精胺40 µL，振荡5 min，冰上静置10 min，使bar基因目的片段沉淀到金粉微粒载体上，12,000 rpm离心5 s，弃上清液，加180µL 70%乙醇漂洗沉淀，冰上静置10 min ，12,000 rpm离心5 s，弃上清，加180µL无水乙醇悬浮沉淀，冰上静置10 min ，12,000 rpm离心5 s，弃上清，加80 µL无水乙醇重新悬浮沉淀，制得金粉重悬浮液，取6 µL制备好的金粉重悬浮液移至载物膜上，制得DNA微弹，晾干备用；

轰击前愈伤组织的培养如下：挑取色泽淡黄、致密、颗粒状、干燥的胚性愈伤组织为转化受体，转移到高渗培养基上暗培养8h；

轰击后愈伤组织的培养如下：轰击后的愈伤组织在原高渗培养基上继续暗培养16～18h后，转移到继代培养基上，恢复培养3 d，得愈伤组织材料；

所述高渗培养基为含有0.2 mol/L Sorbitol、0.2 mol/L Mannitol、1mg/L 2,4-D和5.5 g/L 琼脂粉的MS培养基；

4）抗性筛选：使用除草剂进行抗性筛选，再生培养，得到转基因植株；

采用选择培养基进行抗性筛选，所述选择培养基为含有3 mg/L2,4-D、5 mg/L草丁膦、5.5 g/L 琼脂粉的MS培养基，所述选择培养基的pH值为5.8；

使用分化培养基后和生根培养基进行再生培养，所述分化培养基为含有3mg/L 6-BA、5mg/L草丁膦、5.0 g/L 琼脂粉的MS培养基，所述分化培养基的pH值为5.8；所述生根培养基为含有3mg/L NAA、5 mg/L草丁膦、5.0 g/L 琼脂粉的MS培养基，所述生根培养基的pH值为5.8。

2.如权利要求1所述的甘蔗无载体框架转基因方法，其特征在于，步骤4）后，还包括PCR检测步骤，PCR检测采用如下引物序列：

上游引物SEQ ID No.1：5' -ACCATCGTCAACCACTACAT-3'；

下游引物SEQ ID No.2：5'- AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。

3.如权利要求2所述的甘蔗无载体框架转基因方法，其特征在于，

PCR检测反应体系：模板DNA 50-100 ng，10×Buffer 1.5μL，10 mmol/L dNTP 0.35μL,10 mmol/L 上游引物 0.35μL, 10mmol/L 下游引物0.35μL,25 mmol/L MgCl21.0μL,Taq酶0.2μL,加ddH₂O至15μL；Taq酶的浓度为5 U/μL；

PCR反应条件:95℃预变性3 min;95℃30 sec,60℃40 sec,72℃40 sec,35个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。