[发明专利]一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙M的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程制酶领域，具体涉及一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙M的方法。

背景技术

甜味剂是一类广泛应用于食品、饮料及糖果生产的食品添加剂，其既可以在食品的生产过程中添加，也可以在家庭烘焙时经过适当稀释作为蔗糖的替代品使用。甜味剂包括天然甜味剂和人工甜味剂，前者如蔗糖、高果糖玉米糖浆、蜜糖等，后者如阿斯巴甜、糖精等。甜菊糖是一类从植物甜菊中提取出来的天然甜味剂，目前已被广泛用在食品及饮料中。甜菊的提取物中含有包含瑞鲍迪甙在内的多种甜菊糖，天然提取的甜菊糖不同的批次成分差异较大，需要后续的提纯。目前商业化的产品瑞鲍迪甙A包含一些其它的甜菊糖如瑞鲍迪甙C，D及F等。提取的方法制备的甜菊糖通常还有混有一些杂质，有可能对其使用范围造成一定的影响。瑞鲍迪甙M相较于瑞鲍迪甙A具有优势，但其在甜菊叶中的含量极少，且只在甜菊Morita植株中被检测到(2010，J.Appl.Glycosci.,57,199-209)。目前尚未有瑞鲍迪甙M的商业化生产。

中国专利文献CN103397064A公开了一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，该方法利用大肠杆菌制备的UDP-葡萄糖基转移酶或含有UDP-葡萄糖基转移酶的大肠杆菌，在葡萄糖基供体存在的情况下，催化瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D生成瑞鲍迪甙M。上述方法中，所利用的生产UDP-葡萄糖基转移酶的基因工程菌--大肠杆菌并不是安全的菌株(GRAS，generalregardedassafe)，其在培养过程中会产生毒素，生产的瑞鲍迪甙M不能直接应用，并且大肠杆菌为原核生物，UDP-葡萄糖基转移酶的基因来自于真核生物，因为真核生物和原核生物的蛋白表达过程的复杂程度不同，用原核细菌表达真核来源的酶，会影响酶的活性。酿酒酵母是公认安全的菌株，但是在酵母菌中表达外源基因的表达量较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中含有UDP-葡萄糖基转移酶的大肠杆菌在制备瑞鲍迪甙M的过程中因工程菌自身产生毒素使生产的瑞鲍迪甙M存在安全问题，提供一种通过公认安全菌株酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，该方法可以较低的成本，较短的周期生产出高纯度的瑞鲍迪甙M产品。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，利用含有UDP-葡萄糖基转移酶的重组酿酒酵母或其制备的UDP-葡萄糖基转移酶，在葡萄糖基供体存在的情况下，催化瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D生成瑞鲍迪甙M，所述重组酿酒酵母通过以下方法构建：在质粒中引入强启动子得到载体质粒，将UDP-葡萄糖基转移酶基因通过酶切位点插入到所述载体质粒上置于所述强启动子控制之下得到表达载体，然后转化酿酒酵母，得到重组酿酒酵母。

上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊(Steviarebaudiana)的UGT-A和/或来自水稻(Oryzasativa)的UGT-B。

上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述UGT-A的氨基酸序列与序列表中SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有至少60％的一致性；所述来自水稻的UGT-B的氨基酸序列与序列表中SEQIDNO.3所示氨基酸序列具有至少60％的一致性。

上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述UGT-A的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示，所述UGT-B的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.3所示。

上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述酶切位点为HindIII和XbaI。

上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述强启动子为ADH2或TEF1。

上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述质粒为pYES2。

上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述载体质粒的构建方法为：在质粒内部引入AgeI酶切位点，通过AgeI/HindIII位点引入强启动子。

上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述酿酒酵母为酿酒酵母BY4742。

上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述葡萄糖基供体为UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的UDP-葡萄糖再生体系。

上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，将重组酿酒酵母在细胞通透剂作用下形成重组酿酒酵母透性细胞用于催化。

上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，将重组酿酒酵母进行培养，于冰浴中超声波破碎，将破碎液离心，收集上清液冻干，获得UGT-A或UGT-B的冻干粉用于催化。