[发明专利]一株表达赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建及表达方法

说明书

技术领域

本发明一株表达赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建及表达方法，属于生物工程技术及酶学特征研究领域。具体涉及两个方面：1.一种产赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母及其构建方法；2.重组赖氨酸氨肽酶酶学性质研究。

背景技术

赖氨酸氨肽酶作为一种外切型蛋白酶，在食品、医药和化工等多种领域都有很重要的应用。可用于去除蛋白水解液中的苦味、蛋白质的深度水解、生物活性肽的制备及重组蛋白固定剂或蛋白序列测定所需的工具酶等，在食品、医药保健与化工行业应用前景广阔。

毕赤酵母，作为一种被广泛应用的宿主，已经成功的表达了上百种外源蛋白。它作为一种真核表达宿主与原核相比有许多的优点：高密度发酵，遗传稳定性高，不易染菌，诱导剂便宜，分泌表达等。毕赤酵母会对所表达的蛋白进行翻译后修饰，而这往往会使所表达的蛋白酶的温度稳定性和酶催化效率有所提升。

因此，实现铜绿假单胞菌赖氨酸氨肽酶在毕赤酵母中的表达将具有重要的意义。

发明内容

本发明目的是提供将来源于铜绿假单胞菌的赖氨酸氨肽酶基因导入到毕赤酵母中得到的基因工程菌的构建方法和基本酶学性质研究。

本发明的技术方案：一种胞外分泌表达来源于铜绿假单胞菌NJ-814（CGMCC No.7638）赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建方法，是将来源于铜绿假单胞菌NJ-814的赖氨酸氨肽酶基因PLAP导入到毕赤酵母GS115中得到的基因工程菌，简称为重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-PLAP。利用构建好的基因工程菌发酵制备重组赖氨酸氨肽酶，并研究重组赖氨酸氨肽酶的基本酶学性质。

步骤为：

（1）用赖氨酸氨肽酶基因序列设计一对引物P1、P2，以铜绿假单胞菌NJ-814基因组为模板，P1、P2为引物扩增目的基因；

上游引物P1：5＇-CCGGAATTCA TGGGCAAACC CTAACCC- 3＇，下划线表示EcoRΙ酶切位点；

下游引物P2：5＇-TCCCCTAGGT TACTTGATGA AGTCGTGACC CC- 3＇，下划线表示AvrⅡ酶切位点；

（2）将目的基因连接到表达载体pPIC9K上，获得重组质粒pPIC9K-PLAP，转化E.coli JM109，涂布于含氨苄抗性的LB固体平板上，菌落PCR扩增目的基因、双酶切进行验证阳性转化子，验证正确的重组载体pPIC9K-PLAP送去测序；

（3）测序正确的重组载体pPIC9K-PLAP用Bgl II进行单酶切，经酶切线性化之后，同毕赤酵母感受态细胞混匀，进行电击转化，参数设置1500 V，400Ω，25/50 μF，4-6 ms；将电转液涂布于MD平板，待菌长出来以后分别点接于MM及MD平板，获取重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-PLAP；

（4）筛选获得重组菌，进行表达验证。

用所述的方法构建的重组毕赤酵母分泌表达赖氨酸氨肽酶的方法，所述分泌表达方法如下：

（1）挑取MD平板上的单菌落于25 mL BMGY培养基中，30℃、230 rpm 培养18h；

（2）将培养液置于提前灭过菌的离心管中离心收集沉淀，将沉淀重溶于25 mL BMMY培养基中25℃培养120 h，每隔24 h向培养液中添加终浓度1.5%的甲醇进行甲醇诱导；

（3）将获得的发酵液，10000 rpm 离心5 min，即得赖氨酸氨肽酶粗酶液。

所述赖氨酸氨肽酶基因PLAP来源于铜绿假单胞菌NJ-814基因组，赖氨酸氨肽酶基因PLAP序列如 SEQ ID NO.1 所示。

所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母菌株GS115。

根据所述的重组毕赤酵母分泌表达赖氨酸氨肽酶的方法，将所得赖氨酸氨肽酶粗酶液进行30%-40%的硫酸铵盐析，pH9.0 的Tris-HCl缓冲液透析过夜，之后进行特性研究；特性如下：其最适反应温度为80℃；在50-60℃条件下保温120min后，相对酶活仍高于80%，具有良好的热稳定性；最适pH为9.0，在pH 7.0-9.5之间相对稳定。

根据所述的重组毕赤酵母分泌表达赖氨酸氨肽酶的方法，对重组赖氨酸氨肽酶的底物特异性研究表明：该酶对Lys-pNA水解能力最强，为Leu-pNA的1.7倍。