[发明专利]一种单组份TMB显色液的终止液及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物体外诊断试剂,特别是涉及一种单组份TMB显色液的终止液及其制备方法。

背景技术

体外诊断试剂领域的酶联免疫法(ELISA)检测技术中，常使用TMB(3,3',5,5’-四甲基联苯胺)作为HRP(辣根过氧化物酶)显色底物。相对其它显色底物而言，TMB以显色高效、无毒、不致癌、稳定性好等特点成为ELISA检测的主流显色剂。在ELISA检测时，HRP酶催化过氧化物释放出氧使TMB被氧化成蓝色的产物，加入酸性的终止液终止反应后，蓝色溶液变成橙黄色，在450nm波长有最大吸收峰。终止的原理：以硫酸为主要成分的终止液为例，加入终止液后，一方面，硫酸破坏了HRP酶的活性，使酶的催化功能丧失；另一方面，由于pH降低，可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，联苯醌在波长450nm处有最大消光系数。如不及时终止反应，本底会同时加深，进而影响结果的正确判断，故终止对ELISA具有重要意义。

目前ELISA试剂盒中，TMB的终止液主要有酸和碱两类：酸类主要为盐酸及硫酸，而碱类则为NaOH及SDS(十二烷基硫酸钠)。NaOH由于易与空气中的二氧化碳反应产生变质，而较少应用；至于1％SDS(十二烷基硫酸钠)虽有论文进行过研究，但由于其终止后有较强的褪色作用，结果不稳定，基本仅停留于实验室使用。对于酸类中的盐酸，浓度多为1％或2M(即mol/l，下同)，终止效果尚可，但由于盐酸易挥发，多次开盖会使溶质减少，进而影响终止液的终止效果及检测精密度，故商品化应用不多。

硫酸作为终止液的主要成分，由于稳定、易获取、廉价等优点逐渐成为主流。其所配制的硫酸浓度各异，包括最高达2M，最低为0.2M。而终止液的具体加量：一般双组份TMB底物液各加A与B液50μl后，再加2M的终止液50μl；而对于单组份TMB底物液，则多采用0.2-0.8M的更低浓度硫酸作为终止液，而与TMB加量相同，例如100μl的TMB底物液，加入100μl的终止液。

对于传统的2mol/l的硫酸终止液，多用于双组份TMB，较少应用于单组份TMB中。原因有：(1)单组份TMB中的TMB含量较双组份中的低，故不需高达2M的硫酸来终止，过量的硫酸反而会使本底加深，导致阴阳性对比度较差，最终读数不稳定。(2)2M的硫酸有较强的腐蚀性，对操作者易造成伤害。(3)使用剩余的终止液对环境产生了危害。故现在更多是使用低浓度的硫酸作为终止液，如0.2-0.8M。

基于低浓度的硫酸即稀硫酸在常温条件下可稳定保存，故其可直接保存于常温，在冬季时，特别是广东、海南及台湾省以外的省份，冬季实验室保存或运输时多在0℃以下，易使室温保存的终止液产生冻结；此外，在控温不稳的冰箱冷藏层，终止液也可能出现冻结。冻结的终止液有以下缺点：解冻需要耗费时间；如未完全融化、不均匀会导致硫酸的浓度产生变化，影响实验精密度。

单组份TMB显色液日趋成为商品化ELISA试剂盒主流，目前很少有专门针对单组份TMB显色液的终止液。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种专门针对单组份TMB显色液的终止液，其作用高效且可稳定的保存于四季室温。

本发明提供了一种单组份TMB显色液的终止液，包括硫酸和二乙二醇。

所述硫酸的浓度为0.3-0.5mol/L，所述二乙二醇的重量体积比为3-5％。

所述硫酸的浓度为0.4mol/L，所述二乙二醇的重量体积比为3％。

本发明还提供了一种含有硫酸和二乙二醇的组合物的用途，用于单组份TMB显色液的终止液的制备。

组合物中所述硫酸的浓度为0.3-0.5mol/L，所述二乙二醇的重量体积比为3-5％。

组合物中所述硫酸的浓度为0.4mol/L，所述二乙二醇的重量体积比为3％。

本发明相比现有技术具有如下优势：

(1)本发明单组份TMB显色液的终止液是专门针对单组份TMB底物液设计的，终止后不产生沉淀，1小时内读数仍稳定。

(2)本发明单组份TMB显色液的终止液采用的是低浓度的硫酸，可以减少对操作者的伤害，并且可以降低对环境的危害。

(3)本发明单组份TMB显色液的终止液具有防冻设计，通过其含有的特有防冻成分与低浓度的硫酸以一定比例组合使用，作用高效，且在冬季低温环境使用而不冻结，更加稳定和可靠。

具体实施方式

本发明提供了一种单组份TMB显色液的终止液，包括如下浓度的各组分：

硫酸0.3-0.5mol/L

二乙二醇3-5％(w/v)