[发明专利]一种向日葵白锈病菌和黑茎病菌的多重DPO‑PCR检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种向日葵白锈病菌和黑茎病菌的多重DPO-PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

向日葵白锈病菌(Albugo tragopogonis(Pers.)Gray)是引起向日葵白锈病的病原菌，该病菌在国外少数国家和地区严重发生、经济影响大、传入风险高，成为国际上关注的检疫性有害生物。向日葵黑茎病菌(Leptosphaeria lindquistii Frezzi)是引起向日葵黑茎病的病菌，严重的病田发病率达100％，对向日葵生产造成毁灭性危害，是一种重要的检疫性病原菌。因此，对这两种病原菌进行准确的检疫鉴定非常重要，而传统形态学方法鉴定周期长、时效性差。利用血清学和分子生物学技术鉴定这两种菌的方法已有建立，包括PCR、RFLP等，但这些方法有些需要酶切，检测过程复杂；有些特异性不强或依赖较昂贵的仪器设备，难以在实验室之间推广。因此，建立一种特异性强、且能同时快速检测这两种菌的检测方法显得非常重要。

DPO(Dual priming oligonucleotide)引物技术的主要原理为其引物包含两个各自独立的特异性引物区域，5′端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3′端序列由6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄嘌呤(Inosine,I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5′和3′区域形两个独立功能的双特异性引物结构，并且研究表明5′和3′引物区域中任何有3个及以上碱基的错配，PCR反应将不能进行，而且由于其特殊的结构，引物自身以及引物之间很少形成二级结构且对退火温度不敏感。该技术的优点主要在于它对退火温度、镁离子浓度等影响普通多重PCR的关键因素不敏感，适用范围广，而且该技术特异性强，扩增效率高，为多重PCR技术的应用提供了新的前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何检测待测菌株是向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌的引物组。

本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌的引物组由引物1、引物2、引物3和引物4组成：

所述引物1为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；

所述引物2为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；

所述引物3为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；

所述引物4为SEQ ID No.4所示的单链DNA分子。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌的PCR试剂。

本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌的PCR试剂包括上述引物组。

上述PCR试剂中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4在所述PCR试剂中的终浓度均为0.4μmol/L。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌的试剂盒。

本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌的试剂盒包括上述引物组或上述PCR试剂。

上述引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌中的应用也属于本发明的保护范围。

上述引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在区分或辅助区分向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌中的应用也属于本发明的保护范围。

为解决上述技术问题，本发明最后提供了一种检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌的方法包括如下步骤：

(1)用上述引物组对待测菌株进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(2)检测所述PCR扩增产物的大小；

若所述PCR扩增产物含有大小为307bp的片段，则待测菌株为或候选为向日葵白锈病菌；

若所述PCR扩增产物含有大小为388bp的片段，则待测菌株为或候选为向日葵黑茎病菌

上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测菌株的基因组DNA。

上述方法中，所述PCR扩增为多重DPO-PCR。