[发明专利]构建基因突变测序文库的引物和方法以及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及构建基因突变测序文库的引物和方法以及试剂盒。

技术背景

基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。常见的基因突变有体细胞突变和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。

体细胞突变是发生在正常机体细胞中的突变，比如发生在皮肤或器官中的突变。近年来，癌症基因组的研究发现，癌变过程中与之相关的体细胞突变位点有成千上万处。但是，目前癌症的诊疗却往往会忽视这一点。临床上的治疗策略主要针对数目占优的突变体细胞。以治疗乳腺癌的单抗药物赫赛汀(Herceptin)为例，它的作用靶点是癌细胞过度表达的HER2基因。倘若患者体内的癌细胞中，存在不含HER2基因亚克隆，即便赫赛汀使用之初有效，随着此种癌细胞进化、增殖，同样会导致癌症恶化或复发。这也就解释了，为什么相同的治疗方案，面对不同的患者会有不同的疗效。治愈的癌症患者又存在病情复发的可能。目前与肿瘤的发生、发展或药物疗效相关的体细胞突变主要有：AKT1、AKT3、APC、ATM、BARF、CDH1、CDKN2A、CTNNB1、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、HER2、HRAS、IDH1、IDH2、KIT、KRAS、MEK1、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PIK3R1、PIK3R5、PTEN、PTPN11、RB1、STK11、TP53、TSC1、VHL等。

SNP在人群中的发生频率大于1％，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入或缺失等表现形式。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上，是人种之间、个体之间差异的遗传物质基础之一。SNP作为一种遗传标记得到广泛应用，主要源于以下几个特性：(1)密度高：SNP在人类基因组平均密度估计为500～1000bp，在整个基因组的分布达300万个以上，遗传距离为2～3cm，其密度比微卫星标记高出几个数量级，可以在任何待研究基因的内部或附近提供一系列标记。(2)代表性：某些SNP可能在转录、翻译、拼接以及RNA稳定性等方面发挥重要作用，而某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或者表达水平，因此它们可能代表疾病遗传机制中的某些作用因素。(3)遗传稳定性：SNP来源于数千年前发生的突变，随着人类世代繁衍稳定地遗传至今，和微卫星等重复序列多态标记相比，SNP具有更高的遗传稳定性。具备以上优点，SNP被认为是继第一代限制性片断长度多态性和第二代微卫星多态性之后的第三代分子遗传标记。目前与肿瘤的发生、发展相关的SNP主要有：CYP2D6、DPYD、TYMS、UGT1A1、VEGFA、VEGFR2、VEGFR3、CYP3A5、TPMT、MTHFR、GSTP1、ERCC1、ERCC2以及XRCC1等。

目前已有多种方法可用于基因突变检测，如测序法、DHPLC法、ARMS法、生物芯片等。其中第一代测序技术、ARMS、DHPLC等方法无法实现多个靶标基因并行检测而只能分开多次进行，从而导致使用样本量成倍递增、增加系统误差、检测过程耗时且费用昂贵等问题，使其难以实现规模化。液相芯片检测方法虽然能实现多个基因的并行检测，但是对未知的突变位点具有一定的局限性。

多基因并行检测，不仅增加效率，降低费用，其更为重要的作用是提高检测敏感度和临床敏感度，对基因突变的检测对肿瘤的早筛以及临床个体化治疗有着重要的指导意义。目前，基于多重PCR的多基因并行检测，未能很好解决以下问题：引物内部形成发卡结构或二聚体等二级结构；所设计的引物之间存在非特异性结合，与DNA标签组合形成的标签引物之间形成二聚体、存在错配、与PCR产物之间均存在非特异性结合等。

第二代测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。二代测序是一项新的低成本，高通量，高准确度的快速测序技术，在临床和科学研究方面都有着广泛的应用。

发明内容