[发明专利]一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及电化学检测技领域术，具体涉及一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器及其制备方法。

背景技术

溶菌酶是一种由多形核白细胞分泌的抗菌蛋白质，通常在人体中，溶菌酶具有生理和药物上的功能，例如抗炎、抗病毒、免疫调节和抗肿瘤等。溶菌酶在人体液中的浓度在临床上可以做为许多疾病诊断的标志，例如口咽部念珠菌感染的病人唾液中的溶菌酶的浓度会升高；肾病患者的尿液中会出现溶菌酶；血液、脑脊髓液中溶菌酶的浓度是白血病和中枢神经肿瘤疾病的重要辅助诊断依据，因此对于溶菌酶的检测在临床诊断学上具有重要意义。

通常对于溶菌酶的检测必须先对溶菌酶进行分离，常见的方法有凝胶电泳法、高效液相色谱法、免疫电泳法、酶联免疫吸附法等，这些方法虽然有高的灵敏度，但是具有操作复杂，成本高等诸多缺点。人体液中溶菌酶的浓度较低通常只有10^-7mol·L^-1，因此采用信号放大策略提高检测限对于溶菌酶的测定是非常必要的。

基于核酸适体制备的和具有信号放大功能的电化学生物传感器，在对实际样品检测时不仅无需对溶菌酶进行测定前的分离，而且还具有较低的检测限，较高的灵敏度和较好的选择性，同时电化学的检测方法使其具有成本低，操作简便、省时等优点，因此，制备一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器为溶菌酶的检测提供了一个新的理想选择。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器，利用该电化学生物传感器对溶菌酶进行检测，具有选择性好、灵敏度高等优点。

本发明的第二目的是提供该电化学生物传感器的制备方法。

本发明的第三目的是提供该电化学生物传感器在检测溶菌酶中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计一条报告探针DNA链S1，该DNA链可以与溶菌酶适体链S2互补配对并且自身有16个碱基长度的互补配对序列，能够在适体链脱离后形成颈环结构；S1链的3’端修饰有二茂铁标记物，该标记物可以产生电化学信号；S1链的5’端硫醇化，使得S1通过金-硫键修饰到金电极表面；其中，报告探针S1的DNA链序列为：5’-SH-C6-GTGCAGAGCTAAGTAACTCTGCAC-Fc-3’，如序列表中SEQ ID NO.1所示；适体S2的DNA链序列为：5’-ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’，如序列表中SEQ ID NO.2所示；

(2)将金电极打磨抛光成镜面，再经二次蒸馏水超声清洗，干燥，得处理后的金电极；

(3)报告探针S1在含有三(2-羧乙基)膦的缓冲液中打开二硫键，后将溶菌酶适体S2加入与S1形成双链DNA；

(4)将步骤(2)处理好的金电极浸在步骤(3)得到双链DNA溶液中，将双链DNA修饰到金电极表面，得电化学生物传感器。

步骤(2)中，打磨采用在麂皮上用氧化铝粉末打磨；超声清洗的时间为20～60s。

步骤(2)中，干燥为氮气吹干。

步骤(3)中，所述缓冲液为含有90～110mM Tris-HCl，90～110mM NaCl，9～11mM三(2-羧乙基)膦的混合液，其pH为7.2～7.6。

步骤(3)中S1的浓度为1～2uM，S2的浓度为1～2uM。

步骤(3)中，双链DNA形成条件为：混合液90℃加热4～6分钟，37℃反应2～3小时。

步骤(4)中，电极浸入双链DNA溶液的时间为20～24小时。

本发明还提供了一种上述传感器在检测溶菌酶中的应用，检测步骤为：

(1)将上述传感器在三氯化六氨合钌检测液中浸泡，然后与甘汞参比电极和铂丝对比电极构成三电极系统，进行SWV检测，得到钌的峰电流I_0(RuHex)，二茂铁的峰电流为I_0(Fc)；