[发明专利]高接合转移率的希瓦氏菌WP3菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种高接合转移效率的耐压希瓦氏菌(Shewanella piezotolerans)WP3菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

以WP3ΔSW1为出发菌株，敲除限制内切酶基因，相应获得高接合转移率的菌株；

所述方法具体包括以下步骤：

步骤一，对深海细菌希瓦氏菌WP3全基因组限制-修饰系统相关基因进行预测；

步骤二，对预测到的三个限制内切酶基因分别设计基因敲除引物；

步骤三，以WP3ΔSW1为出发菌株，依次敲除所述的三个限制内切酶基因，相应获得限制内切酶基因缺失菌株Δsw1Δswp840、Δsw1Δswp840Δswp2190、Δsw1Δswp840Δswp2190Δswp9，所述限制内切酶基因缺失菌株即为高接合转移率的菌株；

其中，步骤二中，所述三个限制内切酶基因分别为swp0009基因、swp840基因、swp2190基因；

步骤二中，基因敲除引物中所述swp0009基因的敲除引物为：上游引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，下游引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

步骤二中，基因敲除引物中所述swp840基因的敲除引物为：上游引物如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，下游引物如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；

步骤二中，基因敲除中所述swp2190基因的敲除引物为：上游引物如SEQ ID No.9和SEQID No.10所示，下游引物如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。

2.根据权利要求1所述的高接合转移效率的耐压希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans)WP3菌株的构建方法，其特征在于，步骤三中，所述敲除具体包括如下步骤：

(1)PCR扩增所述限制内切酶基因上下游同源臂，通过融合PCR获得大片段；

(2)连接所述大片段与自杀质粒得重组质粒，将所述重组质粒转化到供体菌E.coliWM3064；

(3)供体菌E.coli WM3064与受体菌WP3ΔSW1进行细菌接合转移实验；

(4)单交换克隆子及双交换克隆子的筛选、鉴定，即得1个限制内切酶基因缺失的菌株；

(5)以所述1个限制内切酶基因缺失的菌株为受体菌，重复步骤(1)至(4)，依次进行第2、3个限制内切酶基因的敲除，即可获得2个限制内切酶基因缺失的菌株、3个限制内切酶基因缺失的菌株。

3.根据权利要求2所述的高接合转移效率的耐压希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans)WP3菌株的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述自杀质粒为pRE112。

4.根据权利要求2所述的高接合转移效率的耐压希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans)WP3菌株的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述筛选具体指通过含氯霉素的抗性平板筛选。

5.根据权利要求2所述的高接合转移效率的耐压希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans)WP3菌株的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述鉴定具体指设计如SEQID No.13和SEQ ID No.14所示的引物进行PCR鉴定。

6.一种如权利要求1所述的构建方法获得的高接合转移效率的耐压希瓦氏菌(Shewanella piezotolerans)WP3菌株作为基因工程菌在基因组大片段删除方面的应用。