[发明专利]一种实时观测枯草芽孢杆菌生物膜生长过程中不同基因表现型细胞和分布的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细菌微生物实验观测技术领域，特别是一种实时观测枯草芽孢杆菌生物膜生长过程中不同基因表现型细胞和分布的方法。

背景技术

生物膜是指细菌在固体或者液体表面形成的包裹在细胞外基质内的具有空间结构的相互关联的复杂微生物群落。自然界中几乎无所不在的生物膜不仅会引起很多的危害，比如医疗器械的污染，慢性疾病的传染；但是也可以加以利用，比如工业废水的净化和生物修复，生物过滤，微生物燃料电池等。生物膜可以在非常恶劣的环境下生长，比如高温高压，不同的酸碱度环境，高强度紫外线辐射以及营养物质极度匮乏的情况等，生物膜这些独特的性质主要源于相同的细菌细胞在生物膜生长的过程中会根据环境的变化分化成不同的基因表现型细胞，这些分工明确的不同的基因表现型细胞使得整个的生物膜菌落能够在极端环境下生存。

尽管对不同的基因表现型细胞的生物学基因序列研究已经比较成熟，但是由于实验技术的局限性不能实时观测到生物膜在形成过程中不用基因表现型细胞的分布、数量和它们之间转化关系。目前分析细胞基因表现型的实验装置有流变仪和用于观测一种或者两种荧光标记细胞的荧光显微镜。

流变仪的方法需要取出生物膜中的一部分区域，然后溶解到特定化学溶液中来对溶液中的细胞计数，从而得到相应区域的细胞数量，要得到整个生物膜中的基因表现型细胞的数量，需要取出非常多小区域的生物膜溶解来计数。这种方法不仅破坏了生物膜完整性，而且因为生物膜非均匀性的特点，这种技术方法并不准确。

第二种荧光显微镜的方法虽然可以在不破坏生物膜的前提下进行，但是目前也只能观测到一种或者两种基因表现型细胞，而生物膜在生长过程中会经历主要三种基因表现型的转化，所以这种实验方法也不能够使我们全面分析生物膜的演化规律。因此目前为止还没有一种方法在不破坏生物膜完整性的前提下实时观测全部主要的三种基因表现型细胞。

发明内容

基于以上的实验方法的局限性，我们提出了一种新的实时观测细菌生物膜在生长演化的同时还能观测在这一过程中细胞基因表现型细胞的转化规律。

该方法可以在不破坏生物膜整体结构形貌的前提下对生物膜进行深入研究，实验方法可以观测随着生物膜的生长细胞经历的不同阶段、分布规律，并得到不同细胞的数量，通过对实验图片的光学分析得到生物膜生长的几何参数与不同功能的基因表现型细胞分布规律、数量以及他它之间的转化规律。

为了实现上述目的，本发明提供一种实时观测枯草芽孢杆菌生物膜生长过程中不同基因表现型细胞数量和分布的方法，包括如下步骤：

(1)三色荧光标记枯草杆菌细菌菌种(3610WT Strain ofBacillus sublilis)。制备方法如下,采用基因转导技术，在不同基因表现型细胞对应的DNA的启动基因上融合上能够编译特定荧光蛋白的基因。三种不同基因表现型细胞的荧光标记分别为：

运动性细胞，荧光标记在hag启动基因与鞭毛蛋白产生基因对应；

分泌细胞外基质细胞，荧光标记在tapA启动基因与产生淀粉蛋白和多糖基因对应；

孢子细胞，荧光标记在sspB启动基因与产生小分子的可溶于酸的蛋白质对应；将制备好的枯草杆菌菌种，储存在零下80度的冰柜中备用。

(2)制备Luria-Bertani细菌培养溶液：采用步骤1中制备的的枯草杆菌菌种，采用如下方式培养细菌菌种：从冰箱中取出的菌种，放入3毫升Luria-Bertani溶液在37度情况下放在持续晃动的恒温箱中培养；采用Luria-Bertani溶液培养步骤1制得的三色荧光标记菌种在培养箱中培养一定时间，采用细胞密度测量仪，直至把细胞培养到OD₆₀₀＝1备用。

(3)制备细菌生物膜生长的基底。生长细菌生物膜的基底材料是含有1.5克/毫升的琼脂的培养生物膜的溶液，将其消毒杀菌后注入培养皿中盖上盖子进行室温冷却，备用；

(4)把三色荧光标记的菌种溶液嫁接到步骤(3)中得到的培养皿表面上；控制培养基底的厚度和细菌细胞的嫁接量使得生物膜能够在两天内细胞能够经历三种主要的基因表现型。