[发明专利]一种胶体金和乳胶微球联合标记的金标免疫层析试纸条的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胶体金和乳胶微球联合标记的金标免疫层析试纸条的制备方法,属于生物医药领域的体外诊断试剂技术领域。

背景技术

目前，传统的胶体金标记技术的研究最早始于上世纪60年代初，胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，能够与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。因为胶体金颜色比较明显，肉眼即可辨别，因此无需任何仪器。胶体金除了与蛋白质结合以外，还能够与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA。

胶体金免疫层析法试纸条的研制原理是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在硝酸纤维素膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，在吸水材料的牵引下，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后，样本中的被测抗原或抗体首先与金标抗体结合成抗原抗体复合物，抗原抗体复合物上行到检测线时，被测抗原的另一结合位点与包被在此处的单抗结合，形成两个抗体结合一个抗原(双抗体夹心)的金标复合物，因有金颗粒在此沉积，故检测线显红色。未结合抗原的金标抗体上行到对照线时，与抗金标抗体结合，所以对照线也显红色。如果待测标本中无被测抗原即阴性样本，试纸条上只有金标抗体上行并与对照线处的抗体结合，因而检测线不显线，对照线显红色。

现在传统的广泛应用的金标免疫层析法试纸条多为用单一胶体金标记，典型的层析法检测试剂的组成成份分为三个部分，其一是多孔材料，包括样品垫、吸水垫、结合垫及硝酸纤维膜；其二是试剂，如抗体、金标结合物；其三是层压结构及卡塞，如PVC板、双面胶、卡塞。

基于胶体金标记技术的免疫层析法体外诊断试剂目前已经有了很广泛大应用，但是仅以胶体金作为标记物和显色剂需要较高浓度的标记物，耗费抗体或抗原的量较多，而且需要较大直径的金颗粒，例如40nm的粒径，才能获得较高的灵敏度，检测低浓度样本时，容易发生假阴性，而当金颗粒过大时，标记物又不稳定，长期贮存容易发生自动聚集。这些缺点导致胶体金标记的免疫层析试纸多集中在定性检测领域，在定量、半定量检测领域没有得到广泛应用。

乳胶标记蛋白一般都是使用羧基和氨基的偶联方法进行偶联的，乳胶表面有羧基，经过活化后和蛋白的氨基结合形成共价键，乳胶标记主要用于胶乳增强免疫比浊法检测，主要是将通常是50nm～500nm粒径的高分子颗粒的乳胶颗粒偶联上抗体，通过抗体的反应，相互交联，通过生化仪的投射或散射光进行扫描，比较反应前后的光路变化，检测抗原的量。主要适用于全自动生化仪，检测结果快速，单个样本检测只需要10min左右，能够大通量检测，灵敏度比较高，能够定量检测。但是因为检测过程中需要全自动生化仪这种大型仪器，因此不利于在诊所或床旁检验推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够克服上述技术问题的胶体金和乳胶微球联合标记的金标免疫层析试纸条的制备方法；本发明的一种胶体金和乳胶微球联合标记的金标免疫层析试纸条的制备方法包括以下步骤：

(1)利用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金溶液，制备的胶体金粒径在30nm～40nm范围内；

(2)用胶体金溶液标记蛋白分子，因为蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，胶体金溶液和蛋白分子这二者容易形成牢固的结合物，如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力，除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量都影响胶体金溶液与蛋白质的结合，因此标记前应调节胶体金的pH值，并选择合适的离子浓度条件标记蛋白分子，标记之前应对待标记的蛋白溶液进行透析，以除去聚合物，胶体金标记蛋白以后应通过离心重悬的方式进行纯化，得到标记胶体金溶液；

(3)直接购买或制备50nm的红色乳胶微球；