[发明专利]一种大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养与鉴定方法

权利要求书

1.一种大鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)取四周龄的SD大鼠，雌雄皆可，按照50mg/kg比例腹腔注射2％戊巴比妥钠，麻醉后，胸腹部剃毛后在超净台内用75％酒精进行胸腹部的擦拭消毒，打开腹腔，腹主静脉放血并换打开胸腔，剪去左心耳，放出肺循环中的血液；

(2)取出心肺，放入DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)中洗涤三次，每次1min；

(3)除去心脏，将肺组织移入新的DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)中进行清洗2次，清洗后，将肺组织移入干燥培养皿中，加DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)，以刚没过肺脏为宜，用细弯镊撕去肺表面的胸膜，剪下2-3mm宽的肺外边缘组织块；

(4)将剪下的边缘组织块移入干燥的培养皿中，用PBS液清洗2次，清洗后，将组织块移入无菌的抗生素瓶中，并加入2ml DMEM培养液(含10％FCS)以刚没过组织块为宜，用眼科剪将其剪成约1mm×1mm×1mm大小的组织块，然后用弯头滴管吸取组织块接种到100mm培养皿中，于5％CO₂培养箱中在37℃条件下培养。

(5)2h后，加入5-6ml ECM培养液(含5％FBS、1％ECGS)，培养液以每隔48h更换1次培养基继续培养，72h后移除组织块，更换培 养基，继续培养；

(6)培养3-5天后，细胞可以汇合成单层，可用于培养P3代细胞；

(7)原代细胞培养3-5天后，细胞汇合成单层，进行传代培养；

(8)弃去培养瓶中的培养液，用PBS溶液洗涤1遍，加入1.5mL 0.125％的胰酶消化，显微镜下见细胞开始皱缩变圆时，吹打培养瓶瓶底使细胞完全脱壁，加入适量含血清培养基终止消化；

(9)将消化的细胞转移到无菌离心管中，1000转/分，离心5min；

(10)弃上清，用含5％胎牛血清的内皮细胞专用培养基重悬细胞，移入75cm2培养瓶中传代培养，24h后第一次换液，之后间隔2-3d换液1次并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。

2.根据权利要求1所述的一种大鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法，其特征在于：所用的大鼠为四周龄的SD大鼠。

3.根据权利要求1所述的一种大鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法，其特征在于：将剪下的边缘组织块移入干燥的培养皿中，用PBS液清洗2次，清洗后，将组织块移入无菌的抗生素瓶中，并加入2ml DMEM培养液(含10％FCS)以刚没过组织块为宜，用眼科剪将其剪成约1mm×1mm×1mm大小的组织块，然后用弯头滴管吸取组织块接种到100mm培养皿中，于5％CO₂培养箱中在37℃条件下培养。

4.根据权利要求1所述的一种大鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法，其特征在于：2h后，加入5-6ml ECM培养液(含5％FBS、1％ECGS)， ECM培养液为血管内皮细胞专用培养液，以每隔48h更换1次培养基继续培养，72-90h后移除组织块，更换培养基，继续培养。

5.一种采用如权利要求1获得的大鼠肺微血管内皮细胞纯度鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)用无菌试管收集P3代的PMVECs两管，每管约2X106个细胞，一管加APC标记抗人CD31抗体，另一管加同型阴性对照，4℃避光孵育30min；

(2)PBS洗涤，1000转/min，离心10min；

(3)弃上清液后再加入0.5mL PBS重悬细胞，200目细胞筛过滤去除细胞团块；

(4)流式细胞仪检测细胞纯度。