[发明专利]一种表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法，属于生物技术领域中的植物组织培养技术领域。

背景技术

虎舌红属于(Ardisia mamillata Hance)紫金牛科(Myrsinaceae)紫金牛属(Ardisia)，是一种多年生常绿小灌木。虎舌红因其通体覆盖茸毛，内藏大量污垢，给组织培养时外植体的表面消毒造成很大的困难，往往导致消毒不彻底而污染率较高或者消毒过度致使外植体生活力丧失，较难获得无菌材料。所以，有效无菌材料的获得是虎舌红组织培养的关键。

常规的植物组织培养中外植体的消毒方法是先流水冲洗，再用酒精消毒30秒到1分钟，再用0.1％的生汞消毒几分钟，无菌水冲洗后最后进行接种。但对于植物全身覆盖茸毛的外植体的消毒方式报道极少，常规的消毒方式往往会造成消毒不彻底而污染率较高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是常规的植物组织培养中外植体的消毒方法对于植物全身覆盖茸毛的外植体不适用，往往会造成消毒不彻底而污染率较高的问题。

为解决上述技术问题,本发明提供的技术方案是：

一种表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)母本植株的预处理：将母本植株移入温室内进行预培养，并进行多菌灵喷洒预处理；

(2)外植体的取材；

(3)外植体的灭菌；

a.外植体的清洗：采用洗涤剂和水清洗；

b.外植体的酒精灭菌：采用75％的酒精灭菌；

c.外植体的升汞灭菌：采取二次升汞消毒；

(4)外植体的接种。

进一步的，所述的母本植株的预处理为在母本植株抽梢前一个月将其移入温室内，进行一定的肥水管理和病虫害防治，并在取材之前两天的时候向芽条上喷洒多菌灵。所述的多菌灵为50％可湿性粉剂800倍液的多菌灵。这样对实验材料进行预处理既可以减少外植体表面及茸毛中隐藏的活性微生物的数量，又可以减少植物组织培养过程中微生物感染概率，还可以保持实验过程中材料间的一致性，从而提高实验的可重复性。

进行外植体的取材时，在植物组织培养过程中，外植体的最佳采集时间是成功建立组培体系的前提。对于虎舌红等的表面带茸毛植物而言，污染和褐变是影响外植体存活的重要因素。因此分别在3月中旬、5月中旬、8月中旬和11月中旬进行，取顶芽及当年生叶片。

进一步的，所述的外植体的清洗为切取当年生枝条和萌蘖条上的茎尖浸泡在加有洗涤剂的水中10～60分钟，用软刷轻轻刷洗外植体的表面，除去附在外植体表面的污垢和部分菌体，然后流水冲洗1～2个小时。

所述的外植体的酒精灭菌为将冲洗后的外植体沥干水分，在超净工作台内放入75％的酒精中分别消毒30秒、45秒、60秒，用无菌水冲洗三次。75％的酒精对植物细胞具有强的穿透性的杀伤力，容易使被处理的外植体受到杀害而丧失生活力，因此把握好消毒时间是保持外植体活性的关键。

进一步的，所述的外植体的升汞灭菌为采取二次升汞消毒的方式进行消毒处理，并且每次使用升汞消毒时在升汞中都含有1mol/L的盐酸。所述的外植体的升汞灭菌为采用二次升汞消毒措施即先用升汞消毒4分钟，无菌水冲洗5次，再用升汞消毒4分钟，无菌水冲洗5次。

所述的外植体的接种为将消毒过的保持有生物活性的外植体接种在预先准备好的加有益培隆的MS培养基里。

有益效果：

本发明的表面带茸毛植物组织培养时外植体消毒方法对母株进行预培养和多菌灵预处理，外植体用酒精消毒后，采用二次升汞消毒措施即先用升汞消毒4分钟，无菌水冲洗5次，再用升汞消毒4分钟，无菌水冲洗5次，然后接种在含有益培隆的启动培养基中。此方法能清除虎舌红外植体表面的污菌并能使外植体保持生活力。

附图说明

图1：本发明的技术路线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1、母本植株的预处理

在母本植株抽梢前一个月将其移入温室内，进行一定的肥水管理和病虫害防治。在取材前二天向植株上喷洒50％可湿性粉剂800倍液的多菌灵。这样对实验材料进行预处理既可以减少外植体表面及茸毛中隐藏的活性微生物的数量，又可以减少植物组织培养过程中微生物感染概率，还可以保持实验过程中材料间的一致性，从而提高实验的可重复性。

2、取材时期