[发明专利]检测噻虫啉的ELISA试剂盒及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种用于定量检测噻虫啉残留量的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

酶联免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)作为新兴的农药残留检测方法，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、检测快速、投入少、测定结果可靠等优点。美国化学学会(AOAC)已将免疫分析与气相色谱、液相色谱同列为农药残留检测的三大支柱技术。美国环境保护署(USEPA)、美国农业部食品安全检验司(FSIS-USDA)和美国化学学会制定了农药残留免疫检验商品试剂盒评定和认可的建议准则，明确了测定结果的法律效应。自从Hammock等首次将免疫技术用于农药残留分析以来，已有几十余种农药建立了酶联免疫分析方法，几乎包括了杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物(昆虫)生长调节剂等所有农药类别，其中杀虫剂有对硫磷、亚胺硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、甲基毒死蜱、三唑磷、毒死蜱、甲胺磷、西维因、呋喃丹、氰戊菊酯、灭多威等；杀菌剂有三唑酮、噻菌灵、克菌丹、异菌眯、硝苯唑、福美双等；除草剂有草甘膦、百草枯、2,4-D、阿特拉津、麦草畏、西玛津、吡草胺、扑草净、精喹禾灵、氯磺隆等；植物(昆虫)生长调节剂有抑芽丹、氟虫脲、甲氧保幼激素等。

噻虫啉是德国拜耳农用化学品公司开发的新型氯代烟碱类杀虫剂，主要作用于昆虫神经接合后膜，通过与烟碱乙酰胆碱受体结合，干扰昆虫神经系统正常传导，引起神经通道的阻塞，造成乙酰胆碱的大量积累，从而使昆虫异常兴奋，全身痉挛、麻痹而死。该种农药作用特点是：具有较强的内吸、触杀和胃毒作用，既可用于茎叶处理，也可用于土壤、种子处理。能够防治水稻、蔬菜、果树、棉花和马铃薯等作物上的大多数害虫，对稻蓟马、稻飞虱等害虫有较好的防治效果。随着噻虫啉使用范围和用量的增大，其在水体、土壤乃至农产品中检出频率和检出浓度越来越高。发展环境中痕量噻虫啉的分析方法，是研究噻虫啉的环境行为和科学评估噻虫啉环境风险的前提。目前对噻虫啉的分析主要使用高效液相色谱法(HPLC)，如韩振泰等采用HPLC法检测白蜡枝叶中噻虫啉的含量方法回收率达到95.7～97.8％，检测限为0.01mg mL^-1，该方法具有很强的代表性，可行性很强；胡敏等使用反向HPLC测定蔬果中的噻虫啉含量，该方法稳定，变异系数小于0.201％，回收率高达99.89％。但是，仪器检测方法还存在诸多不足，如测试成本高、分析时间长、前处理步骤繁琐及对操作人员要求较高等，不能满足环境水体、土壤、农产品等中噻虫啉残留的快速检测的需要。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测噻虫啉的ELISA试剂盒，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。

本发明还要解决的技术问题是提供上述ELISA试剂盒的制备方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述ELISA试剂盒的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种检测噻虫啉的ELISA试剂盒，它包括：用噻虫啉包被抗原包被的酶标板、噻虫啉标准品、噻虫啉多克隆抗体工作液、噻虫啉酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。

其中，所述的噻虫啉包被抗原包被的酶标板按如下方法制备得到：将噻虫啉半抗原与卵清白蛋白(OVA)偶联得到噻虫啉包被抗原附着于酶标板中。

其中，所述的噻虫啉半抗原的制备方法记载于中国专利2015103352632中，专利名称是一种噻虫啉半抗原的合成方法。具体方式是：在氮气保护下将噻虫啉、巯基丙酸(3-MPA)和氢氧化钾(KOH)混合，然后加入二甲亚砜(DMSO)，搅拌至全部溶解；缓慢升温至95～100℃，在95～100℃保温反应2～3h；将反应体系降温至20～25℃，向该反应体系中加水，随后使用盐酸调节反应体系的pH值至3～4；向反应体系中加三氯甲烷进行萃取，收集下层有机层；用盐酸调节有机层液体的pH值至5～6，抽滤，滤液减压脱干得到的固体用甲醇打浆溶解，过滤，滤液减压脱干得到产物；产物过硅胶柱，旋蒸，得到噻虫啉半抗原纯品。

其中，所述的噻虫啉标准品，其溶质噻虫啉的浓度为4.096μg/ml，溶剂为水。

其中，所述的噻虫啉多克隆抗体工作液是采用噻虫啉人工抗原免疫兔制得噻虫啉多克隆抗体，再将噻虫啉多克隆抗体用稀释液按体积比稀释成1:3200的比例，所述的稀释液为含5mg/ml BSA的PBS溶液。