[发明专利]一种肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法

权利要求书

1.肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法，其特征在于，包括下述步骤：

步骤一，肿瘤组织单细胞悬液的制备，即从肿瘤组织块或癌性胸腹水中获取含有肿瘤特异性T淋巴细胞的单细胞悬液；

步骤二：使用免疫磁珠技术将所述单细胞悬液进行分离，得到肿瘤特异性TIL细胞；

步骤三：肿瘤特异性TIL细胞的快速扩增，即将所述肿瘤特异性TIL细胞在高效扩增培养体系中进行高效扩增培养，得到大量的具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性TIL细胞。

2.如权利要求1所述的肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤一中，所述肿瘤组织单细胞悬液的制备，具体包括如下步骤：

(a)取肿瘤组织块，去除正常组织和坏死组织，用剪刀剪成小块组织，将这些小的组织块浸入含胶原酶、透明质酸酶、DNA酶的无血清RPMI 1640培养基中，缓慢摇晃孵育过夜，过滤，得到单个细胞悬液。

如果是从癌性胸腹水中获取含有肿瘤特异性T淋巴细胞的单细胞悬液不需要上述步骤(a)，直接进入以下步骤：

(b)单个细胞悬液或癌性胸腹水用D-Hanks平衡盐溶液洗涤，用Ficoll密度梯度法分离单个核细胞，得到肿瘤组织单细胞悬液。

3.如权利要求1所述的肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤二中，所述使用免疫磁珠技术将所述单细胞悬液进行分离，具体包括如下步骤：

(c)往步骤一所得肿瘤组织单细胞悬液中加入PBS缓冲溶液、抗体溶液、Fc受体阻断剂、磁珠，混匀，重悬得细胞悬液。

(d)将所述细胞悬液加入到细胞分选柱中，利用磁性分离器收集肿瘤特异性TIL细胞。

4.如权利要求1所述的肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤三中，所述肿瘤特异性TIL细胞的快速扩增，具体包括如下步骤：

(e)将步骤二得到的肿瘤特异性TIL细胞与下列试剂和因子混合培养：CM和AIM-V混合培养基，异体辐射致死(50Gy)的PBMC，OKT3抗体。

(f)第2天加入IL-2；

(g)根据细胞数进行扩瓶(袋)培养，培养基为含IL-2的CM和AIM-V混合培养基；

(h)扩增培养到第7-30天，得到最终的大量的肿瘤特异性TIL细胞。

5.如权利要求2所述的肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法，其特征在于，所述含胶原酶、透明质酸酶、DNA酶的无血清RPMI 1640培养基，胶原酶的浓度为0.2-20mg/ml，透明质酸酶的浓度为0.01-10mg/ml，DNA酶的浓度为0.01-10mg/ml。

6.如权利要求3所述的肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法，其特征在于，抗体为生物素(Biotin)标记或荧光染料标记或未标记的PD-1抗体、LAG-3抗体和TIM-3抗体中的至少一种；磁珠为与抗体标记相对应的抗生物素磁珠或抗荧光染料磁珠或抗Ig磁珠。

7.如权利要求6所述的肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法，其特征在于，按每1.0×10⁸个细胞加入抗体溶液10-500ul、Fc受体阻断剂10-500ul、磁珠20-1000ul。

8.如权利要求4所述的肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法，其特征在于，所述CM和AIM-V混合培养基为CM培养基、AIM-V培养基按照1:1的比例混合而成。

9.如权利要求4所述的肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法，其特征在于，所述异体辐射致死(50Gy)的PBMC与所述肿瘤特异性TIL细胞的比值为10:1-1000:1；所述OKT3抗体，按每1.0ml培养基加入0.01-0.1ug OKT3抗体的比例。

10.如权利要求1～9中任意一项所述的分离培养方法分离培养的肿瘤特异性TIL细胞用于肿瘤的治疗或预防。