[发明专利]一种猪体细胞核移植融合方法

说明书

技术领域

本发明涉及克隆技术领域，具体涉及一种猪体细胞核移植融合方法。

背景技术

1997年克隆羊--Dolly出生，开启了动物体细胞核移植技术的新篇章。随后多种哺乳动物如牛、小鼠、山羊、猪、兔等被相继克隆成功。体细胞核移植技术即克隆技术，通常是通过显微操作的方法将受体卵母细胞的细胞核去除，然后将供体细胞注入到已去核的卵母细胞内，形成一个新的重构胚，再通过融合技术将重构胚的供体细胞核导入到去核卵母细胞胞质中，使移入的核在受体胞质的作用下激活发生发育程序重编，使得重构胚能与正常受精胚一样细胞分裂、分化，经过手术移植到代孕母体内发育成一个新的个体，其获得的个体与亲本具有相同遗传性状。从第一例克隆猪(Onishi,2002)诞生至今已有13年，但是整体效率依然没有突破只有1％-2％。如何提高整体的克隆效率，许多实验室进行了大量的研究，包括提高卵母细胞质量、融合激活方法与参数研究、供体细胞处理、胚胎处理、移植方法等。

将供体细胞的细胞核导入到卵母细胞质中，这个过程称之为融合。如果没有细胞融合技术，著名的克隆羊—“Dolly”可能就无法诞生。最早使用的融合技术是使用灭活的仙台病毒(HVJ)(McGrath and Solter，1983)介导细胞融合，获得了成功，但是效果很不稳定而且毒性大。Willadsen等(1986)在利用胚胎细胞克隆羊试验中采用的是直流电介导融合的方法，简便而且高效，电融合技术也是从这个时候开始发展起来的，其原理是通过电流的刺激使紧密接触的细胞膜磷脂双分子层发生结构改变，进而形成细胞间的孔道，随着孔道逐渐扩大使胞质交融在一起。克隆羊“Dolly”就是运用电融合技术，目前已经成为动物克隆中普遍采用的融合方法。若融合率越高，操作速度越快，单位时间生产的胚胎数就越多，体细胞核移植效率也就相应的提高了。

然而，由于技术操作上的差异、融合激活参数、供体细胞类型和操作人员熟练程度等因素导致融合率不稳定，是影响克隆效率的因素之一。由于是在体视显微镜下直接操作，受到视野范围大小的影响，在保证可以看见体细胞的情况下尽可能多操作一些。在实际操作过程中普遍的操作是：将一批重构胚5～10个成一条直线放入融合槽内后(图1)，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行后即施加直流电脉冲诱导融合。一次性操作数量较少，会影响到整体的融合速度。特别对于猪而言，每次需要移植300左右的重构胚，才能有效维持猪的妊娠。一次性操作这么多胚胎，体外融合速度就成了很重要的影响因素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有猪体细胞核移植融合操作过程中，一次性操作数量少，整体融合速度慢的缺点，提供一种猪体细胞核移植融合方法。

本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：

一种猪体细胞核移植融合方法，包含如下步骤：

S1.将构建好的重构胚放入融合液中平衡，然后用融合液洗涤，再放入铺满融合液的融合槽中；

S2.拨动重构胚，使供体细胞与受体卵细胞膜接触面与电极平行放置，同时使重构胚在融合槽中成非直线排列；

S3.用细胞融合仪施加直流电脉冲诱导融合并同时激活，

S4.接着用胚胎培养液洗涤，然后置于培养箱中培养，再在体视显微镜下判定融合情况。

本发明的方法在进行融合操作时，使供体细胞与受体卵细胞膜接触面与电极平行同时使重构胚在融合槽中成曲线排列(图2)，然后施加直流电脉冲诱导融合，在同样的视野下可以增加一次性操作的数量，提高整体融合速度而不会影响克隆胚胎的后期发育。

优选地，S1.所述的融合液的含有0.25mol/L甘露醇(Mannitol)、0.1mmol/L CaCl₂·2H₂O、0.1mmol/L MgCl₂·6H₂O、0.5mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.01％聚乙烯醇(PVA)(w/v)。

优选地，S1.中平衡所用的时间为1～5min，用融合液洗涤的次数为2～5次。

优选地，S2.所述的非直线排列为曲线排列。

优选地，S3.中所述的细胞融合仪的型号为BLS-150B融合仪。

优选地，S3.中所述的直流电脉冲80-100v/mm,80-100μs，脉冲次数为2～3次。

优选地，S4.中所述的胚胎培养液为PZM-3培养液。