[发明专利]快速检测大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子的胶体金免疫层析试纸及制备方法

权利要求书

1.一种快速检测KTI的胶体金免疫层析试纸，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫，特征在于：在纤维素膜设有用KTI兔源多克隆抗体溶液喷点的隐形检测线以及用羊抗小鼠IgG抗体或兔抗小鼠IgG抗体溶液喷点的隐形质控线；所述结合垫吸附有胶体金纳米颗粒标记的KTI鼠源单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征是：所述支撑层用不吸水的韧性材料制成；样品垫用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；结合垫用玻璃纤维棉、聚酯膜、醋酸纤维或尼龙膜制成；纤维素膜用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；吸水垫用吸水滤纸或滤油纸制成。

3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征是：所述隐形检测线和隐形质控线为平行排列的“︱︱”直线式印迹；在所述样品垫、结合垫及吸水垫上覆盖有保护层，在样品垫与结合垫交界处对应的保护层上喷点有样品标记线。

4.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征是：其中KTI兔源多克隆抗体的制备方法如下：

取清洁级3月龄新西兰大白兔，用KTI溶液进行免疫，颈部皮下分4~6点注射，首次免疫剂量为200μg/只，用无菌PBS稀释KTI与等量弗氏完全佐剂混合，25000r/min充分乳化10min；加强免疫剂量增大，为300μg/只，免疫4次，用无菌PBS稀释KTI与等量弗氏不完全佐剂混合，25000r/min充分乳化10min，共免疫4次，每次免疫间隔3周，最后一次免疫30天后以ELISA法测定效价，并鉴定其敏感性和特异性，心脏采血并分离收集血清；以饱和硫酸铵盐析法纯化兔源多克隆抗体，即取1份血清加2份pH7.2的PBS，混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4℃冰箱12h，4℃、10000rpm离心30min，弃上清，再以适量pH7.2的PBS溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度为33％，置4℃冰箱12h，4℃、10000rpm离心30min，弃上清，以适量pH7.2的PBS溶解沉淀，置4℃冰箱内用pH7.2的PBS透析48~72h，中间换液6~8次，4℃、12000rpm离心15min，收集上清，得初步纯化的KTI兔源多克隆抗体；

然后采用Protein G亲和层析柱进一步纯化，先用10倍柱体积的PBS起始缓冲液平衡层析柱，将初步纯化的KTI兔源多克隆抗体用起始缓冲液1:1稀释后，通过0.22μm的一次性无菌过滤器过滤后加样，随后用10倍柱体积的起始缓冲液流洗，除去未结合的抗体，最后用2倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱，用盛有中和液的离心管收集，再用PBS充分透析，备用；所述洗脱缓冲液为0.1mol/L的甘氨酸-盐酸，pH值为 2.5；中和液为0.1mol/L 的Tris-HCl、pH 值为9.0。

5.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征是：其中KTI鼠源单克隆抗体的制备方法如下：

取SPF级6~8周龄BALB/c小鼠，用KTI溶液进行免疫，剂量为50μg/只，背部皮下分4~6点注射，免疫4次，首次免疫用无菌PBS稀释KTI，与等量FCA混合，加强免疫用无菌PBS稀释KTI与等量FIA混合，25000r/min充分乳化10min，免疫间隔3周，确定抗体效价符合要求后，以50μg/只的剂量不加佐剂进行超强免疫，之后3~4天将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死，用体积比为75%的酒精浸泡小鼠5~10min消毒体表，无菌操作取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，1000rpm离心10min，收集脾细胞，将1×10⁸的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，1000rpm离心10min，弃上清，细胞沉淀物于37℃水浴中缓慢加入0.7~1.0mL的 PEG1500作用1min，然后缓慢加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用；37℃水浴5~10 min，1000rpm离心10min弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养板，100μL~200μL/孔，置于37℃、5% 的CO₂培养箱中培养；培养10~14天，用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性孔筛选，将选择的孔进行2~3次有限稀释克隆化，阳性孔扩大培养后建立杂交瘤细胞株；采用小鼠体内诱生腹水法获得腹水，再经纯化得到鼠源单克隆抗体。