[发明专利]血管发生的快速体内模型

说明书

本申请是基于申请日为2007年9月27日，优先权日为2006年9月27日，申请号为200780036277.8(PCT/US2007/079753)，发明名称为：“血管发生的快速体内模型”的专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2006年9月27日提交的美国申请流水号60/848,001和2006年10月12日提交的美国申请流水号60/851,601的优先权，并通过提述并入上述两个申请的内容。

在联邦政府资助的研究下做出的发明的权利声明

此项工作得到了来自(美国)国立卫生院(NationalInstitutesofHealth)、美国癌症学会(AmericanCancerSociety)、和(美国)国立癌症协会(NationalCancerInstitute)的拨款的支持。美国政府对本发明具有某些权利。

发明领域

本发明涉及用于研究生理现象及测定为调控生理现象而设计的药物和方案的有效性的模型系统。具体而言，本发明关注一种动物模型，它可用来评估血管发生(angiogenesis)及评估各种药物对其发展的影响。

发明背景

血管发生、血流、血管内肿瘤细胞运输、和外渗(extravasation)是肿瘤生长、进展和转移中的关键步骤，因此全世界的药物发现研究项目也以它们为靶标。抗血管发生性物质的发现和评估以前依赖于体内方法，诸如绒毛膜尿囊膜测定法、猴虹膜新血管形成(neovascularization)模型、盘式(disc)血管发生测定法、和各种使用角膜来评估血管生长的模型。这些模型在了解血管生长及其抑制的机制中发挥了重要作用。

在我们的实验室中开发了一种新的用于将人肿瘤血管发生成像的转基因裸鼠。干细胞标志物巢蛋白(nestin)在新生血管中表达，而在此转基因小鼠中，巢蛋白的一种调节元件驱动绿色荧光蛋白(NDGFP)，使得新生血管能够通过它们的GFP表达来可视化。许多表达红色荧光蛋白(RFP)的人和啮齿动物癌细胞系被植入ND-GFP裸鼠(nudemouce)中并广泛生长。ND-GFP在正在增殖的内皮细胞中高度表达。通过双色荧光成像来可视化正在生长的肿瘤中的新生血管。Amoh,Y.等,CancerRes.(2005)65:5352-5357。多柔比星(doxorubicin)已被证明可抑制移植有B16F10-RFP鼠黑素瘤的ND-GFP小鼠中的新生肿瘤血管发生及肿瘤生长。Amoh,Y.等,(见上文)2337-2343。

另外，通过双色成像可视化了正位移植有表达RFP的MIAPaCa-2人胰腺癌的ND-GFP转基因裸鼠中的初级(primary)肿瘤血管发生。吉西他滨(Gemcitabine)显著降低了肿瘤中的平均新生血管密度且降低了肿瘤体积。这些结果首次证明了吉西他滨在胰腺癌中不但是肿瘤生长的抑制剂，还是血管发生的抑制剂。Amoh,Y.等,J.Surg.Res.(2006)132:164-169。在进一步的工作中，通过双色荧光成像可视化了ND-GFP转基因裸鼠中XPA-1-RFP人胰腺癌的肝转移的血管发生。ND-GFP在正在增殖的内皮细胞和正在生长的肝转移的新生血管中高度表达。通过ND-GFP表达容易地定量了肝转移中的新生血管密度。吉西他滨显著降低了肝转移中的平均新生血管密度。Amoh,Y.等,AnticancerRes.(印刷中)。

2005年5月12日公布的PCT公开文本WO2005/042715(通过提述并入本申请)也记载了关于可用于观察新血管形成的转基因动物的说明，其中荧光蛋白在巢蛋白衍生的控制序列的控制下表达。

发明公开

本发明提供了上文所述血管发生检测系统的改进。在这种方法中，可以不依赖于肿瘤移植来测量血管发生，这通过在转基因动物中皮下植入的药物投递基质中提供激励新血管形成的适宜生长因子来实现，所述转基因动物在源自巢蛋白的控制序列的控制下生成荧光蛋白。然后可以通过荧光显微术直接观察所述生长基质植入物中新血管的存在。可以在同一动物中植入缺乏生长因子的对照基质，并且也可以观察各种药物和方案对新血管形成的影响。

本发明与血管发生的肿瘤模型相比是有优势的，因为宿主动物不必是免疫缺损的(immunocompromised)。由于不需要导入异种生物材料(除了荧光蛋白本身)，可以使用有免疫活性的(immunocompetent)的受试者。通过适当选择基质，可以采用不引发免疫应答的基质。

如此，一方面，本发明涉及用于观察转基因动物中的新血管形成的方法，该方法包括：