[发明专利]人Tafazzin蛋白的生产工艺方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药工艺领域，具体涉及一种人Tafazzin蛋白的生产工艺方法

背景技术

心磷脂(cardiolipin)是一种高度特异地分布在线粒体内膜的磷脂，是线粒体保持形态完整、进行氧化磷酸化和高效产生ATP的必需分子之一。已证实,在巴氏综合征，糖尿病，心脏衰竭和帕金森病等疾病中线粒体形态改变和功能障碍往往伴随病理性心磷脂缺失及心磷脂支链的改变。因此，研究参与心磷脂代谢的酰基转移酶造成线粒体功能紊乱相关机制，将对疾病发展过程的认识提供新的试验和理论依据，并为其治疗提供可能的靶标和效应分子。

人类tafazzin基因位于X染色体(Xq28)。其编码的tafazzin蛋白，是一组未知功能的蛋白，在心脏和骨骼肌中高表达。Tafazzin基因有12个外显子，由不同的剪接产生129-292个氨基酸的蛋白。Vreken等人发现，人类成纤维细胞中的tafazzin突变后，心磷脂支链的成分亚油酸酰基减少。近期的研究证明，taffazin基因突变的酵母细胞，taffazin蛋白失活，导致心磷脂总含量降低和单溶心磷脂(monolysocardiolipin,MLCL)的积累，同时伴有心磷脂支链中不饱和脂肪酸酰基链的丢失。随后，在人类、酵母和果蝇中，均发现由于tafazzin基因突变导致心磷脂分子种类严重紊乱。因此证实tafazzin参与了心磷脂重塑。在所有tafazzin突变的实例中，心磷脂的优势种类被众多少数种类所取代，表明了酰基转移的随机性。这一结果进一步支持了tafazzin是维持心磷脂分子种类统一及结构稳定的重要重塑酶。在酵母细胞中，tafazzin主要将油酸酰基支链(18:1)和棕榈油酸酰基支链(16:1)转移到心磷脂上。在tafazzin基因突变的酵母细胞内，发现氧化磷酸化偶联缺陷，呼吸复合体移位，进一步证实了异常的心磷脂重塑会引发线粒体功能障碍，证明了tafazzin对心磷脂代谢有重要作用。目前国内外尚未对tafazzin蛋白与心磷脂代谢机制的关系进行深入研究。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供一种人Tafazzin蛋白的生产工艺方法，本发明构建tafazzin全长基因的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达，从而为tafazzin的纯化、抗血清的制备及tafazzin蛋白与CL代谢机制研究奠定了基础，进而为CL代谢异常疾病的治疗提供理论依据。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种人Tafazzin蛋白的生产工艺方法，包括以下步骤：

S1、Tafazzin基因的扩增：以tafazzin全长基因的质粒为模板，经PCR扩增tafazzin基因；

S2、pEASY-E1-tafazzin质粒表达载体的构建及验证：经菌液PCR与基因测序结果鉴定，构建pEASY-E1-tafazzin原核表达载体；

S3、高表达宿主菌筛选：将鉴定正确的重组质粒pEASY-E1-tafazzin分别转化BL21、BL21pLysS,、Transetta三种表达感受态细胞，SDS-PAGE电泳表明Transetta菌株Tafazzin蛋白表达量相对最高，取其作为后期研究的重组菌，进行大量培养，将带有pEASY-E1-tafazzin质粒的菌液分成至少6份的1ml菌液，分别向其中加入终浓度为0～1mmol/L的IPTG；

S4、将带有pEASY-E1-tafazzin质粒的菌液，经IPTG35-37℃或15-17℃诱导后收集菌液，分别取全菌蛋白样品、上清可溶蛋白样品和沉淀蛋白样品，通过SDS-PAGE电泳对tafazzin蛋白小量诱导表达条件进行摸索并对其可溶性进行分析；

S5、Tafazzin蛋白westernblotting鉴定。

优选的，步骤S2所述的IPTG为诱导剂。

优选的，步骤S2所述IPTG的加入终浓度分别为1mmol/L，0.5mmol/L，0.25mmol/L，0.1mmol/L，0.05mmol/L，0mmol/L。

优选的，步骤S4所述IPTG的温度为37℃或16℃。

(三)有益效果