[发明专利]蟹壳下脚料抗氧化肽链的制备方法

权利要求书

1.蟹壳下脚料抗氧化肽链的制备方法，所述抗氧化肽链为Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp，其制备方法包括下述步骤：

1）蟹壳下脚料预处理：取过100目筛的蟹壳下脚料，按照料液比1g: 5 ~10mL加入异丙醇，于40~50℃脱脂8~10 h，然后于8000~10000 rpm离心10~15 min除去异丙醇，收集脱脂蟹壳下脚料固形物；

2）蟹壳下脚料的酶解：将上述脱脂蟹壳下脚料固形物按固液比1g:10~15mL加入磷酸盐缓冲液，混合液温度升至45~50℃、超声处理10~15 min；然后按脱脂蟹壳下脚料固形物质量的1.0~1.5%加入中性蛋白酶，在45~50℃酶解4~6 h；将酶解液升温至90~95℃后恒温保持10~15 min，酶解液温度降至50~60℃，按脱脂蟹壳下脚料固形物质量的2.0~2.5%加入木瓜蛋白酶，在50~60℃酶解4~6 h，冷却至室温，于9000~10000 rpm离心10~15min，除去沉淀物，得到酶解液；步骤2）磷酸盐缓冲液为0.05 mol/L，pH 6.5~7.5；

3）蟹壳下脚料抗氧化肽链的制备：将步骤2）制备得到的上述酶解液采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得到超滤酶解液；将超滤酶解液按照体积比加入到装有6～8倍DA201-C大孔树脂的层析柱中，用4～5倍柱体积双蒸水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的70%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经阴离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得到蟹壳下脚料抗氧化肽链；

所述步骤3）的阴离子交换树脂层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：

离子交换树脂层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为45~50 mg/mL的溶液，经过DEAE Sepharose FF阴离子交换树脂层析柱分离，用水、0.25~0.35 mol/L和0.45~0.55mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对羟基自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解物；

凝胶柱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为15~20 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高羟基自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物；

RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，收集羟基自由基清除活性最高的 1 个抗氧化肽，经 RP-HPLC 检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1）中的蟹壳，其来源为三疣梭子蟹。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）中的RP-HPLC条件为进样量8~10 μL；色谱柱为规格250 mm×4.6 mm，5 μm的 Hypersil BDS C₁₈；流动相为含0.1%三氟乙酸的25%乙腈；洗脱速度为0.5~0.8 mL/min；紫外检测波长215 nm。