[发明专利]一种利用杏鲍菇废菌糠制备固体漆酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于漆酶提取技术领域，具体涉及一种利用杏鲍菇废菌糠制备固体漆酶的方法。

背景技术

漆酶具有广泛的底物作用范围，可以氧化降解包括单酚、邻苯二酚、对二等多种酚类化合物及其衍生物，也可以氧化降解一些不含酚羟基的酚类类似物，还可以氧化降解一些有机磷毒物。因此，漆酶具有很多重要的生物学功能，尤其在纸浆生物漂白、废水处理、环境污染物质去毒与降解方面显示出较大的研究价值和应用潜力。而杏鲍菇是目前工厂化生产主要品种之一，是我国工厂化第二大产量的食用菌产品，年产量达13万吨，杏鲍菇（Pleurotus eryngii）在栽培过程中菌丝通过产生大量的木质素降解酶系降解栽培料的木质素及其纤维素，其中漆酶是木质素降解酶系关键酶之一，因此栽培后废弃菌袋中富含有漆酶等多种胞外酶，工厂化栽培会产生大量的废菌包，废菌包来源稳定，为工厂化提取漆酶生产提供了稳定原料来源，在市场上有着巨大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用杏鲍菇废菌糠制备固体漆酶的方法，旨在为漆酶的应用提供更为科学的依据及低成本生产、稳定的来源。杏鲍菇废菌糠提取的漆酶在多环芳烃生物修复方面有着广阔的应用前景。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用杏鲍菇废菌糠制备固体漆酶的方法：将杏鲍菇废菌糠粉碎后，加入蒸馏水溶解，在24℃，pH自然，110 rpm摇床振荡1h；4℃，8000 rpm离心15 min，取其上清液，采用冷丙酮沉淀，50mM pH 6.0的磷酸缓冲液溶解，DEAE-sepharose阴离子交换柱层析，收集50 mM pH 6.0磷酸缓冲液的洗脱液，冷冻干燥，得到固体漆酶。

粉碎速率28000 r/min，粉碎时间30s。

杏鲍菇废菌糠与蒸馏水的质量体积比为1：10。

离心后的上清液与丙酮的体积比为1：1。

制得的固体漆酶的酶活为10220U/L，酶分子量为44.3kDa。

本发明的显著优点在于：本发明旨在为漆酶的应用提供更为科学的依据及低成本生产、稳定的来源。杏鲍菇废菌糠提取的漆酶在多环芳烃生物修复方面有着广阔的应用前景。

附图说明

图1是丙酮比例对漆酶沉淀率的影响。

图2是DEAE-sepharose离子交换柱层析蛋白洗脱峰。

图3是杏鲍菇漆酶的SDS-PAGE图，A为蛋白Marker；B为纯化后的漆酶蛋白；C为丙酮分级沉淀后的样品。

图4是漆酶最适温度。

图5是漆酶热稳定性。

图6是漆酶最适反应 pH。

图7是漆酶 pH 稳定性。

具体实施方式

1 材料与方法

1.1 试剂

ABTS即2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)，购于SouthernBiotech公司，分析纯。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Adventurer^TM天平：AB204-E，奥豪斯国际贸易(上海)有限公司；

实验室超纯水设备：WP-UP-111-20，四川沃特尔水处理设备有限公司；

恒温振荡摇瓶柜：HYG-A，太仓市实验设备厂；

冷冻离心机：EppendorfCentrifuge5804R，上海富众生物科学有限公司；

恒温水浴箱：HS-6001，江苏省杰瑞尔电器有限公司；

微波炉：PJZIC-BI，美的微波电器制造有限公司；

真空冷冻干燥机：LGJ-10，北京松源华兴科技发展有限公司；

自动部份收集器：BS-100A-LCD，上海琪特分析仪器有限公司；

实验室pH计:STARTER3C，奥豪斯仪器(上海)有限公司；

紫外可见分光光度计：PHarmaciaBiotechultrospec2000；

双垂直电泳仪：DYCZ-24EN型，北京六一仪器厂。

1.3 杏鲍菇采收后栽培料粗酶液的制备

将杏鲍菇采收后栽培料进行处理后，混匀，然后称取10 g，加蒸馏水定容至100 mL，在24℃，pH自然，110 rpm的条件下，振荡，1h；4℃，8000rpm离心15min，取其上清液，即为粗酶液，置于4℃冰箱保存备用。

1.4 漆酶酶活的测定