[发明专利]树突状细胞抗原负载方法

说明书

技术领域

本发明属于生物肿瘤抗原与载体结合培养技术领域，具体涉及一种树突状细胞抗原负载方法。

背景技术

树突状细胞(Dendriticcell，DC)是人体内功能最强大的专职抗原呈递细胞，也是唯一能刺激初始型T淋巴细胞的抗原呈递细胞，能够诱导持久有力的特异性抗肿瘤免疫反应。作为机体免疫应答的始动者，DC在肿瘤免疫、抗感染免疫、免疫排斥等方面的重要作用已被深入研究。负载抗原的DC疫苗已成功应用于转移性前列腺癌、恶性黑色素瘤、多发性骨髓瘤和慢性髓性白血病等肿瘤的治疗。

树突状细胞与肿瘤的发生、发展具有密切关系：

1.以肿瘤抗原体外专一性地冲击致敏、激活抗原呈递功能最强的树突状细胞，可保证肿瘤抗原被有效摄取。

2.树突状细胞通过细胞表面高水平的MHCⅠ、Ⅱ类分子呈递了丰富的肿瘤抗原肽，使相应的T细胞受体(TCR)被充分占据；同时，树突状细胞提供高水平的协同刺激分子B71(CD80)、B72(CD86)、CD40等，使T胞被充分激活。

3.树突状细胞与T细胞结合后，可以大量分泌IL-12，激发T细胞增殖，诱导CTL生成，主导了TH1型的免疫应答，有利于肿瘤细胞的清除。

4.树突状细胞还能分泌趋化因子(DCCCK)专一性地趋化初始型T细胞，通过促进T细胞聚集，增强对T细胞的激发。

然而，人体内大部分DC处于未成熟状态，共刺激因子和粘附因子表达低水平较低，体外激发同种混合淋巴细胞增殖反应的能力较低，但未成熟DC具有较强的迁移能力和极强的抗原吞噬能力，在摄取抗原(包括体外加工的抗原)或受到某些因素刺激时即分化为成熟DC，而成熟的DC表达高水平的共刺激因子和粘附因子，抗原提呈能力较强，能有效激活初始型T淋巴细胞，诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)生成，启动抗肿瘤反应。

DC在血液中仅占单个核细胞总数的0.5％-1.0％，数量很少，因此，体外培养的DC对于制备抗肿瘤的DC疫苗具有重要意义。目前DC疫苗的常规制备方法是将肿瘤抗原加入底面铺满DC的培养瓶中，或者是将DC收集起来悬浮于离心管中再加入肿瘤抗原。前者需要大量的肿瘤抗原；后者DC与肿瘤抗原的接触面积较低，影响了DC对肿瘤抗原的摄取量，进而影响DC的抗原提呈效果。

发明内容

为了解决DC疫苗制备过程中肿瘤抗原使用量大、DC与肿瘤抗原接触面积较低以致DC摄取肿瘤抗原的数量较低的问题，本发明设计一种树突状细胞抗原负载方法，实现节约肿瘤抗原的使用量，并且增加DC与肿瘤抗原的接触面积，提高DC摄取肿瘤抗原的数量的目的。

实现上述目的技术方案是，本发明开发出的一种树突状细胞抗原负载方法，包括如下步骤：获取树突状细胞，并将其与免疫磁珠结合后置于磁场中，再加入肿瘤抗原共培养，得到负载上肿瘤抗原的树突状细胞。

在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述免疫磁珠为携带有CD209单抗的免疫磁珠。

在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述免疫磁珠的直径范围为100-300nm。

在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述磁场强度小于或等于20mT。

在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述肿瘤抗原为结肠癌抗原、肝癌抗原和肺癌抗原中任意一种。

在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述树突状细胞的来源为：从血液中分离出单个核细胞，经体外诱导培养转化成树突状细胞。

在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述体外诱导培养的培养液为含体积分数为1％PPP、浓度为50ng/mlGM-CSF、浓度为500IU/mlIL-4的基础培养液。

在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述共培养步骤中还包括向所述已负载肿瘤抗原的树突状细胞里加入TNF-α、白介素和脂多糖中的一种。

在本发明提供的树突状细胞抗原负载方法中，所述TNF-α的浓度为1-10ng/ml、或白介素的浓度为5-15ng/ml、或脂多糖的浓度为1-10ng/ml。

实施本发明提供的树突状细胞抗原负载方法，可以达到以下有益效果：通过加入免疫磁珠并置于磁场中，增加了树突状细胞与肿瘤抗原的接触面积，进一步促进树突状细胞负载抗原的效率，并且节约了肿瘤抗原的使用量，提高树突状细胞的免疫活性。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。