[发明专利]一种丁烷氧化菌丰度的自动化检测方法

说明书

本发明公开了一种丁烷氧化菌丰度的自动化检测方法。包括构建原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站、样品处理、采用工作站自动液体处理装置完成移液、自动核酸提取设备提取与纯化DNA、琼脂糖电泳检测、丁烷氧化菌丰度的荧光定量PCR检测、获得结果等步骤。本发明基于自动分析方法，使丁烷氧化菌的核酸提取与纯化步骤实现自动化；使其特异基因PCR反应体系的配制实现自动化，减少手工操作引入的人为因素造成的误差，操作步骤在洁净环境中运行，整个检测过程通过计算机软件控制，检测流程可以追溯，可实现系统误差的统一校正。

技术领域

本发明涉及油气和水合物勘探与油气和水合物藏表征技术领域，更具体地，涉及一种丁烷氧化菌丰度的自动化检测方法。

背景技术

中国是一个能源消耗大国。2013年我国石油的对外依存度接近60％。随着工业化和城镇化进程的加快，我国对油气与水合物能源的需求进入持续增长期。我国虽然正在实施节能减排和新能源发展战略，但是在相当长时期内我国仍然无法摆脱对油气资源的依赖，因此我国能源安全已被提上重要日程。为缓解我国能源紧张局面，加大力度勘探和更加高效地开发油气与水合物迫在眉睫，而高效的勘探方法及其配套装备的是解决能源需求的关键途径之一。

油气和水合物勘探领域包含地质勘探、地球物理勘探、地球化学勘探和微生物勘探四大核心技术。其中前三种勘探技术相对微生物油气与水合物勘探技术而言已趋于成熟。微生物勘探属油气和天然气水合物勘探领域四大核心技术之一，是依据地表土壤/沉积物/水中微生物异常进行能源潜力评价的重要方法。微生物勘探技术因其快速、经济、结果易解释等优势而倍受学界的关注。微生物勘探方法具有快速、经济和结果易解释等优势。然而，因土壤、沉积物和水体中99％以上微生物不可培养，故基于培养法而建立的传统微生物勘探方法在检测精度上很难满足勘探要求；因气态烃微渗漏是动态和不连续的，故传统微生物勘探方法无法在微裂隙处于挤压状态的区块发现气态烃微渗漏；采用单一的活菌异常指标难以在现今沙漠、戈壁和海洋深水等环境开展勘探；传统微生物勘探方法用于油气藏表征时需两次采样，这不仅显著增加成本，且在很多开采区无法实施，因我国多数油气藏未开展过微生物表征。

微生物油气与水合物勘探技术的不成熟性主要表现在：(1)面对丰度很低、对油气与水合物具有指示意义的、专性或兼性微生物的复杂样品，基于微生物培养法而建立的传统微生物油气与水合物勘探技术，不仅很难测准其微生物丰度(因为土壤和沉积物中99％以上的微生物不可培养)，数据可靠性差；(2)无法发现微裂隙处于挤压状态的勘探区油气与水合物藏；(3)面对复杂多样的油气与水合物勘探区，特别是沙漠、戈壁、盐碱地和海洋深水区，基于微生物培养法而建立的传统微生物油气与水合物勘探技术基本失效；究其原因，主要是传统微生物油气与水合物勘探技术仅依赖于单指标的活菌异常；(4)基于培养法的传统油气与水合物勘探技术对样品的处理效率非常低，通常一批样品至少需要14天才能获得结果，周期长，效率低，成本高；(5)数据影响因素多、波动大，在分析测定流程中会引入大量的人为误差；检测流程不可追溯，且无法进行系统误差的校正。

王江海等基于微生物单细胞和基因的原态检测技术，率先提出原态微生物油气与水合物勘探技术的概念、原理和技术方案，并在甲烷氧化菌活菌体外特异性荧光染色、甲烷-丁烷氧化菌死菌和活菌的快速定量检测、微生物油气与水合物勘探多重指标的设立和油气与水合物田区微生物群落变性梯度凝胶电泳分析的PCR策略等方面取得重要进展，形成以气态烃氧化菌及其关联菌类的活菌、死菌和总菌异常为多重勘探指标的微生物油气与水合物勘探技术，但目前仍然需要用手工方法检测微生物丰度，无法根本性解决微生物油气与水合物勘探技术的缺陷。

原态微生物油气与水合物勘探技术(IsMOST)是基于现代分子生物学技术的油气与水合物勘探技术，只有实现低丰度微生物样品的大批量快速处理，以及在配套装备技术领域取得根本性的突破的基础上，才有可能真正将原态微生物勘探技术运用于油气和水合物勘探方面。

发明内容