[发明专利]一种甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法

权利要求书

1.一种甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.构建原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站；所述工作站包括自动液体处理装置、核酸提取设备、PCR反应体系配置系统；

S2.样品处理，每个样品得到大于1.5ml的上清液；

S3.采用所述原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站的自动液体处理装置完成移液；具体是执行自动液体处理装置设定的程序，将不同的试剂通过自动控制机械臂上移液通道和移液模块的动作自动加入对应的样品板、结合板、洗涤板和洗脱板中；

S4.核酸提取设备提取与纯化DNA，将所有的样品板都准备好后，执行所述原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站的设定程序，得到土壤和/或沉积物中的总基因组DNA；核酸提取与纯化流程结束后经自动液体处理装置将样品的核酸提取液转移至微量PCR管中，标记清楚后于-20℃冰箱中保存；

S5.琼脂糖电泳检测；

S6.经实时荧光定量PCR检测，获得甲烷氧化菌丰度；

其中，步骤S1所述自动液体处理装置包括操作平台、机械臂、移液通道及实验用品的载架和辅助设备；在所述操作平台上设置有若干定位轨道，所述实验用品的载架固定放置于上述定位轨道上；

所述机械臂上装载移液工具和移板机械手，所述移液工具包括单个或多个独立控制的移液通道，所述机械臂带动移液通道精确移动；移液通道上设置若干移液模块以及纳升级的微量点样模块；

所述辅助设备包括样品振荡装置、孵育装置、样品装载装置、样品编号扫描和记录装置、实验耗材的转移装置、上下游设备的衔接装置；

所述核酸提取设备包括大体积提取磁头及大体积提取磁头控制装置；在所述核酸提取设备中内置多个核酸纯化程序，通过电脑软件控制而实现自动化操作；

所述移液通道依据通道内活塞的移动来推动空气进行吸液和放液；

所述机械臂上的每个移液通道都设有独立的动态定位系统；移液通道直接自动装卸一次性吸头或可重复使用的针式吸头。

2.根据权利要求1所述甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法，其特征在于，S5步骤所述琼脂糖电泳检测操作方法如下：

(1)取5μl DNA提取液于1％琼脂糖上电泳鉴定，DNA Ladder为DL2000；

(2)若有>2kbp条带，则取5μl DNA提取液加灭菌水稀释20倍后作为PCR模板并在4℃下保存，样品基因组DNA提取液保存于-20℃。

3.根据权利要求1所述甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法，其特征在于，S6步骤所述甲烷氧化菌丰度的荧光定量PCR检测包括以下步骤：

(1)甲烷氧化菌的培养；

(2)设计特异性引物；

(3)制备标准品；

(4)建立实时荧光定量PCR的反应体系和反应条件；

其中，PCR反应体系的配制在所述原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站中完成；

操作流程如下：

S61.将配制好的PCR反应体系，经自动液体处理装置分装于灭菌离心管中，每管大于0.5ml，置于制冷保存的载物架中；

S62.将原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站提取与纯化的带核酸样品的深孔板一起置于载物架中，作为DNA模板；

S63.执行原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站设定的程序，将建立PCR反应体系所需的混合试剂和DNA模板依次加入对应的、新的深孔板中，即完成PCR反应体系的配置；

(5)对样品进行实时荧光定量PCR检测，分析实验结果，即可获得样品中甲烷氧化菌的丰度。

4.根据权利要求3所述甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法，其特征在于，步骤(2)所述引物序列为：

F:5’-CTGGCAGGGCATTCAGGATT-3’；

R:5’-GAAGAAGGGCGTCAGCGTGT-3’。