[发明专利]一种快速测定肠道或粪便中短链脂肪酸含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及肠道或粪便中短链脂肪酸含量的测定。

背景技术

肠道微生物菌群主要是指在人体远端肠道中丰富多样地存在同时对人体的健康和营养起到关键作用的肠道菌群的总称。肠道微生物是人体重要的“微生物器官”，与免疫、营养、代谢等诸多生理功能紧密相关。人体肠道为微生物提供了良好的栖息环境，在成人肠道内，微生物数量高达10¹⁴，接近人体体细胞数量的10倍；质量达到1.2 kg，接近人体肝脏的质量；其包含的基因数目约是人体自身的100倍，具有人体自身不具备的代谢功能。作为人体最庞大、最复杂的微生态系统，肠道微生物的代谢产物不仅能调节人体健康，更在膳食和宿主之间起到了重要的桥梁作用。正如诺贝尔奖获得者Joshua Lederberg曾指出的，人体与人体共生微生物构成了超级生物体，肠道微生物的代谢产物对人体能产生巨大作用。近年来，相关方面的研究已经成为世界各国科学家关注的热点。

研究发现，在大肠环境中，肠道微生物在远端肠道中定植并能分泌降解碳水化合物等营养物质的酶。肠道菌能利用碳水化合物等多种营养物质而产生短链脂肪酸等代谢产物，其中主要为乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。这些短链脂肪酸的产量能降低大肠的pH，并因此抑制一些有害病原菌的增殖、影响微生物酶活和抑制大肠癌变。以上这些都能对大肠健康产生有益影响，并对人体生理健康发挥重要作用。同时，这些短链脂肪酸的氧化能为人体结肠组织提供超过70%的耗氧。乙酸能被大脑、心脏和外周组织氧化利用。丙酸可以影响肝脏和胆固醇代谢。丁酸能作为结肠上皮细胞的能量来源调节上皮细胞和免疫细胞的生长和凋亡、抑制结肠炎和结肠癌、调节氧化应激，并能影响粘液层的组成。另外，短链脂肪酸还有维持水电解质平衡、抗病原微生物以及调节肠道菌群平衡、改善肠道功能、调节免疫、抗炎、抗肿瘤和调控基因表达等重要作用。近年来，研究者们正逐步意识到大肠的健康（尤其是肠道菌及其代谢产物）与多种慢性疾病风险的降低间呈相关性。Nature、Science、J Exp Med、P Natl Acad Sci USA等国际一流学术期刊最新研究表明：很多慢性疾病，如肥胖，糖尿病，肠炎等病人其肠道短链脂肪酸的含量与正常人群具有显著性差异。在人群中，测定肠道或粪便中的短链脂肪酸含量能成为评价和帮助判断多种慢性疾病的初筛指标之一。

因此，建立一种快速测定肠道或粪便中短链脂肪酸含量的方法对于在大量的样本中进行慢性疾病（如肠炎等）的初筛，显得尤为重要。但到目前为止，还没有搜索到对于快速测定肠道或粪便中短链脂肪酸含量方法的相关文献。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、快速和准确的肠道或粪便中短链脂肪酸含量的测定方法。

本发明是通过以下技术方案实现的。

（1） 将肠道内容物或粪便用蒸馏水以1: 9 ~ 1: 14进行均质稀释，混匀后，将混合物离心15-20 min（转速为6000 转/min），取0.5-1 ml上清液用于测定短链脂肪酸含量。

（2）通过Agilent 6890 N气相色谱和HP-INNOWAX色谱柱进行色谱分析。

气相分析条件：FID检测器，载气为N₂；N₂的流速为19.0 ml/min，分流比为1:10。空气的流速为300 ml/min，H₂的流速为30 ml/min；检测器温度为240℃，进样口温度为240℃。

升温程序为：100℃保持0.5 min后，按4℃/min的升温速度升温至150℃，测定时间共13 min。样品进样量为0.2-0.5 μl，且每次每个样品均进行3次独立重复测定，通过HP Chem工作站软件（A.09.xx，Agilent）进行数据分析。

（3）对建立的气相方法进行方法学验证。

配制短链脂肪酸的标准溶液（混标及单标），同时标准曲线浓度范围设定为：乙酸2-80 mmol/L；丙酸1.5-60 mmol/L；正丁酸1-50 mmol/L；异丁酸0.1-5 mmol/L；正戊酸0.1-5 mmol/L；异戊酸0.1-5 mmol/L（每个标准分析物设定10个浓度梯度，每个浓度的标准分析物平行测定五次）。每个分析物的最低检测限（LLOD）等于每个分析物相对于噪音信号5倍的浓度（峰面积），即测定5个空白中添加的某种标准分析物的浓度。

通过测定样品的回收率确定测定方法的准确度，回收率通过下式进行计算：

RR% =c₁/ c₂ ×100