[发明专利]一种农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法及应用

权利要求书

1.一种农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)选取荻成熟种子，消毒、清洗后依次进行愈伤组织诱导、继代培养；

(2)将继代培养后的胚性愈伤组织置于含有农杆菌菌液的侵染液中侵染，所述农杆菌菌液带有表达载体；侵染后的胚性愈伤组织在共培养基上进行共培养；

(3)取共培养后的愈伤组织依次经无菌水和含羧卞青霉素的无菌水清洗，然后移至含有羧卞青霉素和潮霉素的选择培养基上进行筛选；

(4)将筛选得到的抗性愈伤组织移至分化培养基上，进行分化培养，诱导出不定芽；

(5)将分化出的不定芽移至生根培养基上，培养成完整植株。

2.根据权利要求1所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，进行愈伤组织诱导的培养基组成为：以MS培养基为基础添加6mg/L2,4-D、0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、0.5g/L脯氨酸、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝胶；pH5.8。

3.根据权利要求1所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，所述表达载体为pCAMBIA1300。

4.根据权利要求1所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，步骤(2)中在侵染液中侵染的时间为5-10min。

5.根据权利要求1所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，共培养基的组成为：以MS培养基为基础培养基，添加1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆醇、10mg/L盐酸硫脘素、0.1g/L肌醇、3.9g/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸、0.5g/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝胶；pH5.8；高压灭菌冷却至55℃时加入乙酰丁香酮至终浓度为200μM。

6.根据权利要求1所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，步骤(3)中利用选择培养基进行两轮筛选：

所述选择培养基的组成为：以MS培养基为基础培养基，添加6mg/L2,4-D、0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、0.5g/L脯氨酸、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝胶；pH5.8；第一轮筛选的选择培养基在高压灭菌后加入300mg/L羧卞青霉素和80mg/L潮霉素；第二轮筛选的选择培养基在高压灭菌后加入300mg/L羧卞青霉素和100mg/L潮霉素。

7.根据权利要求1所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，所述分化培养基的组成为：以MS培养基为基础添加0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.05mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝胶；pH5.8。

8.根据权利要求1所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，所述生根培养基的组成为：以1/2MS培养基为基础培养基，添加0.4mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝胶；pH5.8。农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法。

9.一种如权利要求1～8任一权利要求所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法在培育荻转基因植株上的应用。