[发明专利]一种鉴别阿胶真伪的半巢式‑多重PCR法

说明书

技术领域

本发明涉及食药检测技术领域，具体涉及一种鉴别阿胶真伪的半巢式-多重PCR法，用于鉴别阿胶中是否掺杂有马、猪和牛源性成分。

背景技术

阿胶在中国有数千年的食用历史，具有补血止血，滋阴润肺的功效。它是驴皮熬制后形成的一种特殊中药材，主要成分为胶原蛋白。纯正的阿胶必需来自百分百的驴皮，方能保证产品的营养功效。由于阿胶功效独特，供不应求，多地均出现假冒伪劣产品。这些劣质胶多采用猪、牛、马等动物皮、骨、结缔组织熬制，用肉眼难以鉴别，常规的鉴别方法也难以区分，临床使用后不仅达不到治疗效果，反而会出现中毒现象。

2002卫生部发布的《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》，规定了阿胶被列为既是食品又是药品。阿胶在《中国药典2010》有相关质量规定：以驴皮熬制的胶为阿胶正品。但作为食品和保健品，目前还没有国家标准，造成了目前阿胶的监管不明朗，同时也为阿胶造假提供了较大的空间。这些伪品的存在严重干扰了市场正常秩序，损害消费者利益，影响正规产品的信誉。为了取缔和预防假冒伪劣阿胶产品，除了需要质量监管部门加大执法力度，首要前提就是要具备科学可靠的检测方法。

中国专利(CN201510018058.3)公开了鉴别阿胶中多种动物源性的引物探针组合物、试剂盒及多重实时荧光定量PCR检测方法，检测特异性不佳，检测灵敏度以及检测时间均不能满足期望。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种能同时鉴别阿胶中是否掺杂有马、猪和牛源性成分的方法，能够在保证检测特异性的前提下，提高现有以PCR技术为基础的阿胶真伪检测方法的检测灵敏度，实现同时检测多种动物源性成分，缩短了检测时间。

本发明的技术方案是一种鉴别阿胶真伪的半巢式-多重PCR法，包括如下步骤：

(1)采用液氮研磨法处理阿胶样品，再用改良的SDS法提取DNA，备用；

(2)根据物种线粒体DNA序列设计通用引物正向引物P1和反向引物P2，然后以步骤(1)中制备的DNA为模板进行第一轮PCR扩增，获得扩增产物；

(3)以步骤(2)中PCR扩增产物为模板，用正向通用引物P1和特异反向引物A、B、C、D进行第二轮多重PCR扩增；

(4)将(3)中PCR产物电泳，根据电泳条带大小判断阿胶中是否掺杂有马、猪和牛源性成分。

进一步的，所述步骤(2)正向引物P1核苷酸序列为5’-CCMTCAAACATYTCATCATG-3’，反向引物P2核苷酸序列为5’-CTGGGTCTCCMAGMAGGTC-3’。

进一步的，所述步骤(3)中第二轮多重PCR的引物核苷酸序列分别如下：

驴特异反向引物A：5’-TTTCACAGTAATAGCCACAGCAT-3’；

马特异反向引物B：5’-TCATCACAGCCCTGGTAGTCGTA-3’；

猪特异反向引物C：5’-GCCTTCCACTTTATCCTGCCATTC-3’；

牛特异反向引物D：5’-AGGCGGATTCTCAGTAGACAAAGC-3’。

进一步的，所述步骤(2)中第一轮PCR条件为：引物P1和P2浓度为1μM，比例为1∶1，退火温度50℃，反应循环数25，延伸时间7min。

进一步的，所述步骤(3)中第二轮PCR条件为：引物P1、A、B、C和D浓度为1μM，比例为4∶1∶1∶1∶1，退火温度48℃，反应循环数30，延伸时间10min。

本发明的检测方法流程如下：

1.4种动物(驴、马、猪和牛)皮和阿胶DNA的提取

(1)称取适量(0.2g)的样品，放入用液氮预冷的研钵中，然后缓缓地向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状，置于1.5ml离心管中；

(2)向处理过的样品中加入600μL预冷的TE裂解液，然后再加入60μL的10％SDS溶液和10μL的蛋白酶K，55℃放置3-12h；

(3)将上述消化液降至室温，加入无DNA酶的RNA酶10μL，37℃放置0.5-1h；

(4)将样品放置冷却至室温，然后加入200μL的醋酸钾溶液，在振荡器上剧烈振荡20s，使其充分混合。4℃下12000r/min离心5min；

(5)小心将上清液转移到另一个1.5ml离心管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，v/v)溶液，充分混合后，12000r/min离心5min，多次重复此操作步骤，直到两相中间不能看到明显的变性蛋白质为止；