[发明专利]一种耐高温木聚糖酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于酶基因改造技术领域，具体涉及一种耐高温木聚糖酶突变体及其应用。

背景技术

木聚糖(xylan)广泛存在于自然界中，是半纤维素的重要组分，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一。在被子植物中木聚糖占干物质重的15％-30％，在裸子植物中占干物质重的7％-12％。但木聚糖具有很强的抗营养作用，在动物的消化道内不能被消化和吸收，而且会影响其它养分的吸收利用，因而大大限制了富含木聚糖饲料(大麦、小麦、黑麦等)的应用。木聚糖酶(Xylanase)是指能专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称。人们对木聚糖酶的研究早在六十年代就已开始，主要研究集中在食品、饲料、造纸、能源工业等方面的木聚糖酶，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶。并分离出多种木聚糖酶基因，已工业化生产多种木聚糖酶产品。

因为目前在颗粒生产过程中有一个短暂的80-90℃的高温阶段。青霉菌来源木聚糖酶热稳定性较差，其水溶液在65℃下保温5分钟剩余酶活性低于30％，使该酶在颗粒饲料的应用受到限制。采用饲料制粒后木聚糖酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且对酶制剂的稳定性、饲料中分布均一性都无法很好的保证。因此，提高木聚糖酶热稳定性对目前饲料用木聚糖酶具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐高温木聚糖酶突变体及其在饲料中的应用。本发明通过对来源于绳状青霉(Penicillium funiculosum)的木聚糖酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，其耐热性得到显著提高，有利于其在饲料领域的广泛应用。

申请人通过对来源于绳状青霉的木聚糖酶进行大量突变的筛选，发现N34C、S103Y、T175C、S184C和T187C这五个突变位点能引起木聚糖酶耐热性的提高，从而促成本发明。

本发明一方面提供了一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的木聚糖酶的第103位氨基酸由Ser变为Tyr。

上述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO：4的木聚糖酶突变体的质粒。

本发明一方面提供了另一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：3的木聚糖酶的第175位氨基酸由Thr变为Cys，第184位氨基酸由Ser变为Cys。

上述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：6。

本发明还提供携带编码序列为SEQ ID NO：6的突变体基因的质粒。

本发明还提供了一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：3的木聚糖酶的第34位氨基酸由Asn变为Cys，第187位氨基酸由Thr变为Cys。

所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：7，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：8。

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO：8的突变体基因的质粒。

本发明还提供了一种宿主细胞，包含携带有木聚糖酶突变体基因的质粒。

所述宿主细胞优选为毕赤酵母(Pichia pastoris)。

本发明提供的野生型木聚糖酶XynPF在65℃条件下处理5min后仅残留28％左右的酶活，在75℃、80℃条件下处理5min后酶活残留率几乎为0；而含S103Y单点突变的木聚糖酶突变体XynT1在65℃条件下处理5min后能保持50％以上的酶活，在75℃、80℃条件下处理5min后仍能分别保持35％、30％的酶活；而含S103Y/T175C/S184C三点突变的木聚糖酶突变体XynT3.1和含S103Y/N34C/T187C三点突变的木聚糖酶突变体XynT3.2在65℃条件下处理5min后均能保持90％以上的酶活，且在75℃、80℃条件下处理5min后仍能分别保持45％、35％左右的酶活。此外，与野生型相比，本发明筛选到的木聚糖酶突变体XynT1，XynT3.1和XynT3.2的最适作用pH值未发生变化，仍为5.5，但其耐热性均得到显著提高，因此更适合在饲料中的广泛应用。

具体实施方式：