[发明专利]检测TLR7/8介导的NF‑κB信号通路中关键分子含量的特异性引物、扩增程序及定量试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，是一种基于聚合酶链式反应（PCR）的分子生物学方法，特别是涉及荧光定量聚合酶链式反应（Q-PCR）。

技术背景

mRNAs是普遍存在于动物生物体内的核苷酸，其表达量受到多种因素的调节。mRNA的表达量也对蛋白质的合成有重要作用。通过定量mRNA的表达水平可以反映蛋白质的表达量，间接的表现各种蛋白质在生物体内生物学功能的变化。TLR7/8介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子的差异表达在抗病毒的研究中有着至关重要的作用。

目前所知，NF-κB调节的靶基因编码蛋白至少包括细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、粘附分子、免疫受体、氧化应激相关酶以及急性期蛋白等。通过靶基因表达产物， NF-κB信号通路参与了感染、炎症、免疫反应等过程。

Toll样受体(Toll like receptor，TLR)是上世纪末发现的一类天然免疫受体， 1997年Medzhitov等.率先报道了人类TLR，随后受到了广泛的关注。 Toll样受体分布十分广泛，主要表达于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、多形核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞及自然杀伤细胞等表面，属于模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)，可对病原体相关分子模式(pathogen associated molecu—lar patterns，PAMP)进行识别、结合，并引发一系列信号转导，进而导致炎性介质的释放，在天然免疫防御中起着重要作用，并最终激活获得性免疫系统。

Toll样受体7/8 (Toll—like receptors，TLR7/8)可识别某些种类病毒ssRNA，TLR7/8识别病毒后依赖MyD88途径将信号下传，激活细胞内转录因子核因子κB (NF-κB)信号通路发挥先天抗病毒免疫反应，导致共刺激分子活化和细胞因子产生，并引发随后的特异性免疫应答， 以起到天然免疫防御的作用。

NF-κB信号通路的作用十分广泛，尤其是在天然抗病毒免疫防御中起到重要的作用。根据目前的研究表明，病毒可以通过激活NF-κB信号通路，进而诱导固有免疫功能改变，目前研究病毒致病或者感染机制中更注重宿主在病毒感染过程中免疫反应变化。在病毒感染机体后，快速有效的检测NF-κB通路中关键分子的差异性表达对我们研究病毒的感染机制是非常必要的，但是目前的检方法由于技术缺陷、操作繁琐、试验时间长、无标准化、成本高等原因让试验者面临很大的困难。我们通过建立荧光定量PCR技术平台，开发出便捷的检测方法。该方法依靠PCR技术的高灵敏性和荧光定量技术，可以一次性对TLR7/8介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中的多个关键分子基因进行相对定量，检测病毒感染后不同时期TLR7/8介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路关键分子的表达量的差异，并通过荧光定量的方法将结果直观的表现出来，以更加简便快捷的研究病毒的致病机制。

通过对感染病毒机体组织或者体外感染细胞，完成中RNA或者短片段RNA的提取，在荧光定量PCR仪上进行检测，快速获得结果。这个过程可以有效的缩短实验时间，减少经费使用和试剂仪器使用。本发明可以同时检测多种mRNA的动态变化，使的原来很难采用统一常规技术检测的一组数据可以通过标注化的试剂盒在短时间内得到表达差异，并完成定量分析。

目前，还没有开发出一种准确、快速、简单费用低廉的检测TLR7/8介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子mRNA表达水平的技术。本发明基于荧光定量，通过一整套的特异引物进行荧光定量分析，进行相对定量的检测，解决了目前对TLR7/8介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子快速检测的技术瓶颈。同时，我们对检测的关键分子在96孔板上进行合理排布，使其得到更加充分的利用，能过更加高效的进行研究分析。

发明内容

本发明的目的是开发出一种准确、快速、简单的检测TLR7/8介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子mRNA表达水平的技术。本发明基于荧光定量，通过一整套的特异引物进行荧光定量分析，进行相对定量的检测，解决了目前对TLR7/8介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子快速检测的技术瓶颈。同时，我们对检测的关键分子在96孔板上进行合理排布，使其得到更加充分的利用，能过更加高效的进行研究分析。

本发明的技术方案是：

一种检测TLR7/8介导的NF-κB信号通路中关键分子含量的特异性引物，序列如下：