[发明专利]一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法

权利要求书

1.一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)珊瑚样品预处理；

2)制备珊瑚样品匀浆液，过滤后得滤液；

3)在滤液中加入Teepol试剂，混匀，以无菌2216培养液稀释后，涂布于2216固体培养基上培养，在2216固体培养基上生长的菌落即为珊瑚共生细菌。

4)细菌的计数。

2.如权利要求1所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于在步骤1)中，所述珊瑚样品预处理的方法是以无菌蒸馏水冲洗珊瑚样品的表面，将表面的杂物清洗干净，放置在干净的培养皿上晾干。

3.如权利要求1所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于在步骤2)中，所述制备珊瑚样品匀浆液的具体方法为：将预处理后的珊瑚样品放入无菌离心管中，加入2216培养液和陶瓷珠，盖好离心管盖，放置在振荡仪中，对离心管中的混合物进行振荡均质处理，得珊瑚样品匀浆液。

4.如权利要求3所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于所述预处理后的珊瑚样品与2216培养液的配比为(0.2～0.5)g∶1mL，其中，预处理后的珊瑚样品以质量计算，2216培养液以体积计算。

5.如权利要求3所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于所述陶瓷珠的用量为20～30颗。

6.如权利要求3所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于所述振荡均质处理的条件为2600rpm下振荡60～80s。

7.如权利要求1所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于在步骤2)中，所述过滤的方法为：将匀浆液倒入装配3.0μm无菌滤膜的预灭菌的过滤器，连接过滤器到真空泵，过滤分离珊瑚骨架；所述无菌滤膜的直径可为25mm；所述过滤器可采用15mL玻璃滤杯；所述真空泵的真空度可＜5MPa。

8.如权利要求1所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于在步骤3)中，所述Teepol试剂的加入量为在每毫升滤液中加入10μL Teepol试剂；所述稀释的方法是采用梯度稀释法，将细胞液体分别按原液，10倍和100倍稀释后各取100μL涂布于2216固体培养基上，每个稀释度3个平行培养皿；所述培养可于恒温培养箱25℃温度下培养5～7天。

9.如权利要求1所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于在步骤3)中，若培养皿上的菌落之间分割不明显或者长成成片的细菌菌落，则说明该培养皿对细菌的分离失败，重复步骤1)～3)，若步骤3)中的稀释倍数需增加一个1000倍稀释梯度，则对珊瑚共生细菌重新进行分离。

10.如权利要求1所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于在步骤4)中，所述细菌的计数的具体方法是将2216固体培养基上生长出来的单一圆形的细菌菌落的数量进行统计，选择菌落数在30～300个之间的培养皿，以该稀释度3个平行培养皿的平均菌落数乘其稀释倍数，即为该珊瑚样品共生细菌数。