[发明专利]一种组织工程软骨支架及其制备方法

权利要求书

1.一种组织工程软骨支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A：提取Ⅱ型胶原蛋白；

步骤B:利用所述Ⅱ型胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素以及羟基磷灰石制备初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架；

步骤C:利用EDC/NHS系统将步骤B中的初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架进行交联，再冷冻干燥得到CII-HA-CS-HAP三维软骨支架；

步骤D:对所述CII-HA-CS-HAP三维软骨支架进行消毒，得到可应用于人体的组织工程软骨支架；

其中，所述步骤B包括：

B1：将步骤A提取的Ⅱ型胶原蛋白制备成浓度为1%-2%(m/V)的Ⅱ型胶原蛋白溶液；

B2：用去离子水分别溶解透明质酸HA和硫酸软骨素CS，在4℃条件下，搅拌使其完全溶解得到终浓度为1%-2%(m/V)的透明质酸溶液，1%-2%(m/V)硫酸软骨素溶液；

B3：将上述透明质酸溶液和硫酸软骨素溶液进行混合；

B4：在透明质酸溶液和硫酸软骨素溶液的混合溶液中加入透明质酸溶液或者硫酸软骨素溶液质量的4-14倍的Ⅱ型胶原蛋白溶液，并不断搅拌；

B5：添加Ⅱ型胶原蛋白，透明质酸和硫酸软骨素总质量的30%-80%的羟基磷灰石得到混合溶液体系；

B6：将上述混合溶液体系在4摄氏度条件下继续搅拌，得到均一的混合溶液；将上述均一的混合溶液转移至24孔板中，真空冷冻干燥得到初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架；

所述步骤C包括：

C1：将所述初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架在乙醇、MES混合溶液中室温条件下浸泡30分钟；

C2：继续将所述初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架浸泡在含乙醇、MES、NHS、EDC混合溶液中，并置于培养箱中20℃-25℃条件下交联24-36小时；

C3：再在震荡条件下，将该三维软骨支架在磷酸氢钠溶液中洗涤两次，每次15-30分钟；氯化钠溶液中多次洗涤；三蒸水多次洗涤后，真空冷冻干燥，得到CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述的Ⅱ型胶原蛋白从牛骨、猪骨、羊骨中提取得到或者所述Ⅱ型胶原蛋白通过基因工程菌株生产得到。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述步骤D中，所述CII-HA-CS-HAP三维软骨支架通过紫外线、Co⁶⁰灭菌或环氧乙烷灭菌进行消毒。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述步骤B6中，将上述混合溶液体系在4摄氏度条件下继续搅拌，得到均一的混合溶液后再通过3D打印机得到初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。

5.一种应用权利要求1至权利要求4中任一方法制备的组织工程软骨支架，其特征在于，

该组织工程软骨支架吸水率为300-600%，孔隙率为90%以上，孔径为50-300 μm，抗压强度为大于8kPa。

6.根据权利要求5所述的组织工程软骨支架，其特征在于，

所述组织工程软骨支架3周的降解率为15%-35%。

7.根据权利要求5所述的组织工程软骨支架，其特征在于，

所述组织工程软骨支架经过小鼠成软骨细胞ATDC-5培养，使得成软骨细胞ATDC-5生长良好。